Expunerea intrauterină la doze mici de DBP la șoareci induce obezitatea la descendenți prin suprimarea
Subiecte
Abstract
Introducere
Obezitatea este o boală metabolică caracterizată prin dezechilibru energetic și acumulare excesivă de grăsime. Cu toate acestea, mecanismele care cauzează boala nu au fost încă pe deplin elucidate. Se știe că factorii genetici, dieta slabă și stilul de viață sedentar sunt principalele cauze ale obezității, dar doar 16% dintre indivizii obezi sunt obezi genetic. O ipoteză propune că factorii de mediu sunt principala cauză a obezității, deși nu au fost clarificați exact factorii de mediu care duc la obezitate. Ipoteza obezogenilor sugerează că substanțele chimice care afectează endocrin (EDC) din mediu sunt principala cauză a obezității 1,2 .
Esterii ftalatici (PAE), care sunt utilizați pe scară largă la fabricarea materialelor plastice au fost implicați ca EDC și studiile au sugerat că expunerea la doze mici de PAEs poate fi asociată cu obezitatea. Un studiu transversal pe 5149 de subiecți efectuat de Studiul Național de Sănătate și Nutriție (NHANES) a găsit o asociere semnificativă statistic a indicelui de masă corporală (IMC) și circumferința taliei cu ftalați 3. Într-un studiu prospectiv al adulților în vârstă de 70 de ani de la Universitatea Uppsala din Suedia, sa constatat că rezistența la insulină este strâns corelată cu expunerea la metaboliții ftalatului 4. Acest studiu a dezvăluit că metaboliții ftalatului pot interfera cu metabolismul glucozei prin calea receptorilor cu proliferator activat de Peroxisom (PPAR). Există, de asemenea, dovezi că mono (2-etilhexil) ftalatul (MEHP) interferează cu transformarea biologică a țesutului adipos, perturbă sistemul hormonal endocrin și determină neregularitatea sistemului de control hipotalamic - hipofizar - suprarenal pentru a promova formarea grăsimilor printr-un varietate de căi biologice, inclusiv interferența cu hormoni steroizi sau tiroidieni și activarea PPARs 5 .
Materiale și metode
Animale și tratamente
Șoarecii SPF C57BL/6J cu vârsta de 8 săptămâni au fost obținuți de la Laboratory Animal Center din cadrul Universității Jilin (Changchun, Jilin, China). Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă standard care conținea (g%): 22,60% proteine, 50,87% carbohidrați, 3,37% lipide, 3,33% fibre, 6,88% minerale și 12,95% apă și au fost menținuți la 22 ± 1 ° C cu o lumină de 12 ore/ciclu întunecat și hrană și apă ad libitum. Experimentul pe animale a fost realizat în conformitate cu Ghidul Institutelor Naționale de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator și a fost aprobat de Comitetul de Îngrijire și Utilizare a Animalelor din cadrul Universității Beihua.
Măsurători ale compoziției corpului
La sfârșitul studiului de 21 de săptămâni, compoziția corporală a șoarecilor a fost analizată cu precizie în ceea ce privește grăsimea corporală totală și masa slabă utilizând analizorul de compoziție a corpului animalelor mici (Minispec LF-50, Bruker, Germania).
Teste de toleranță la glucoză și insulină
La sfârșitul săptămânii 21, șoarecii au postit timp de 18 ore pentru un test de toleranță la glucoză sau 6 ore pentru un test de toleranță la insulină. Sângele a fost dobândit din vena cozii și s-a măsurat nivelul glicemiei în repaus (timpul 0) folosind ultraglucometre One-Touch (Life Scan). Animalelor li s-a administrat apoi fie 2 g/kg glucoză, fie 0,75 U/kg insulină (Humulin regulat, Eli Lilly și Company) prin injecție intraperitoneală. Curbele glicemiei au fost trasate pe baza glucozei din probele de sânge prelevate la 15 min, 30 min, 60 min și 120 min după injectare, iar aria de sub curbă (ASC) a fost calculată.
Studii de colivie metabolică
Animalele individuale au fost adăpostite în cuști cu un ciclu de întuneric/lumină de 12 ore la temperatura camerei (22 ± 1 ° C). Aportul bazal de alimente și apă, eliminarea urinei și a fecalelor, consumul de oxigen (VO2), producția de dioxid de carbon (VCO2) și activitatea locomotorie au fost determinate în această perioadă de sistemul calorimetric TSA (TSA System, Germania) și Cheltuielile energetice (EE) )) și coeficientul respirator (RQ) au fost calculate utilizând acești parametri. Temperatura a fost măsurată în anus.
Chimii serice și hepatice
Probele de sânge au fost centrifugate la 3000 rpm timp de 10 min pentru a obține serul, iar țesuturile hepatice au fost omogenizate. Insulina serică de post și leptina serică de post au fost măsurate cu kituri ELISA de la Dingguo Changsheng Biotechnology (Beijing, China). Nivelurile serice de TG, TC, acizi grași liberi (FFA), TG hepatic și hepatic TC au fost determinate folosind seturi de testare corespunzătoare (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Jiangsu, China).
Analiza histologică
Țesuturile au fost fixate în paraformaldehidă 4% (pH 7,4) timp de 24 de ore la temperatura camerei, încorporate în parafină și secționate în felii groase de cinci micrometri. Secțiunile WAT și pancreasul au fost colorate cu hematoxilină și eozină (Dingguo Changsheng Biotechnology, Beijing, China), iar secțiunile ficatului au fost colorate cu roșu ulei O (Wuhan Goodbio technology Co., Ltd., Wuhan, China). Imaginile au fost realizate cu o cameră digitală (DP20, Olympus, Tokyo, Japonia) pentru a evalua histopatologia țesuturilor.
PCR în timp real pentru a măsura expresia
ARNm total al țesutului adipos maro (BAT) a fost izolat cu RNAiso plus (TaKaRa Dalian Biotechnology, Dalian, China). Transcrierea inversă a fost efectuată de Prime Script RT Reagent Kit (TaKaRa Dalian Biotechnology, Dalian, China). PCR cantitativă în timp real folosind SYBR Premix Ex Taq Mix (TaKaRa Dalian Biotechnology, Dalian, China) a fost realizată într-un sistem ABI Q6 în timp real de PCR (ABI, Carlsbad, CA, SUA). Volumul total de reacție a fost de 7, l, inclusiv 0,25 (l din fiecare primer (10 uM), 2 (l de ADNc diluat de zece ori, 3,5 (l de SYBR Premix Ex Taq și 1 (l de H2O fără RNază). Condițiile specifice de reacție au fost: 2 minute la 95 ° C, urmate de 40 de cicluri de 15 s la 95 ° C și 1 min la 60 ° C. Rezultatele au fost normalizate la niveluri de β-actină (Metoda 2 -Ct). Primerii utilizați au fost obținuți de la Sangon Biotech (Shanghai, China) și sunt enumerați în Tabelul 1.
Analiza Western blot
BAT a fost separată, congelată în azot lichid și depozitată la - 80 ° C până la utilizare. Pentru analiza Western blot, probele au fost omogenizate în tampon RIPA conținând 0,1% PMSF (KeyGEN BioTECH, Nanjing, China), centrifugate (12.000 ×g, 15 min, 4 ° C) și supernatantul a fost colectat. Conținutul de proteine a fost determinat folosind un kit BCA (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, SUA). Cantități egale de proteine (60 μg/bandă) au fost separate pe geluri SDS-PAGE de 8% și apoi transferate pe membranele PVDF. După blocarea cu 5% lapte degresat timp de 2 ore la temperatura camerei, membranele au fost incubate cu următorii anticorpi primari: β-actină (1: 500, Santa Cruz, CA, SUA); Decuplarea proteinei 1 (UCP1) (1: 1000, Santa Cruz); Proteina de imunoglobulină de legare (Bip) (1: 1000, Santa Cruz); CCAAT/proteină omologă de legare a amplificatorului (Chop) (1: 1000, Santa Cruz) în TBS-T conținând 3% BSA peste noapte la 4 ° C. Membranele au fost apoi incubate cu anticorp secundar conjugat cu HRP (diluție 1: 5000, Dingguo Changsheng Biotechnology, Beijing, China) la 37 ° C timp de 2 ore. După trei spălări în TBS-T, imaginile au fost detectate folosind un sistem de detectare chemiluminiscentă (Tanon Image System Ver.5200, Shanghai, China).