Expresia periferică susținută a adiponectinei transgenice compensează dezvoltarea induse de dietă

Editat de Kenneth I. Berns, Universitatea din Florida, Gainesville, FL și aprobat la 17 septembrie 2003 (primit pentru revizuire la 24 iunie 2003)

periferică

Abstract

Obezitatea, recunoscută de Organizația Mondială a Sănătății ca o problemă de sănătate de proporții pandemice, este o tulburare metabolică complexă de etiologie multifactorială, care duce adesea la rezistență la insulină, dislipidemie, hipertensiune arterială, afectarea fibrinolizei și numeroase alte afecțiuni patologice, inclusiv cancerele (1) . În țările occidentale, 2-8% din costurile de îngrijire a sănătății sunt atribuite obezității (2), iar această statistică este agravată de o rată slabă de tratament de succes. Până în prezent, nu a fost stabilit un tratament farmacologic eficient, deoarece medicamentele anti-obezitate actuale invocă o mulțime de efecte secundare dăunătoare (3, 4).

Printre potențialele molecule terapeutice, leptina nu a reușit să îndeplinească așteptările ca medicament ales pentru obezitatea indusă de dietă (DIO), deoarece marea majoritate a pacienților supraponderali sunt rezistenți la leptină (5). Când a fost administrată central, leptina a mediat inițial un efect anorexigenic mai robust (6), dar apoi a apărut pentru a promova dezvoltarea rezistenței la leptină centrală în creierul de șobolan expus la expresia constitutivă extinsă a transgenului de leptină (7, 8).

Metode

Animale și dietă. Șobolanii Sprague - Dawley (Harlan Breeders, Indianapolis) au fost îngrijiți în conformitate cu principiile din Ghidul Consiliului Național de Cercetare pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator (ref. 19; disponibil la http://oacu.od.nih.gov /regs/guide/guidex.htm). Șobolanii au fost adăpostiți individual la 23-24 ° C cu un ciclu de lumină/întuneric de 12:12 h. Animalele au fost hrănite ad libitum cu unul dintre următoarele două tipuri de dietă, după cum s-a indicat: chow de laborator standard (12% din kcal sub formă de grăsime; Dieta de laborator, St. Louis), denumită în continuare dieta normală (ND) și dieta bogată în calorii. (60% din kcal sub formă de grăsimi; Research Diets, New Brunswick, NJ), denumită în continuare dieta bogată în grăsimi (HF).

Construcție vectorială. ADNc care codifică Acrp30 murin a fost obținut prin clonarea mediată de RT-PCR utilizând ARN total izolat din țesutul adipos alb. La verificarea secvenței, a fost identificată o mutație cu un singur punct (A 382/G) care a schimbat Met-113/Val. ADNc a fost utilizat „așa cum este”, fără a reveni reziduul înapoi la secvența raportată (9), deoarece alinierea secvenței Acrp30 murin și apM1 uman (20) a relevat prezența unui reziduu Val în poziția respectivă a ortologului uman, iar mutația a fost considerată irelevantă din punct de vedere funcțional. Vectorul rAAV care transportă ADNc Acrp30 murin a fost asamblat utilizând coloana vertebrală pTR-UF (21). Caseta de expresie transgenă cu flancuri TR conținea următoarele elemente genetice: potențator citomegalovirus/promotor β-actină de pui (22), ADNc Acrp30, element de reglare posttranscripțional al virusului hepatitei woodchuck (23) și situsul de poliadenilare a hormonului de creștere bovin.

Ambalarea, titrarea și administrarea vectorilor rAAV. Plasmida de transfer pTR-Acrp30, care conține caseta de expresie Acrp30, a fost ambalată în capside serotip AAV1 sau AAV5. Serotipurile 1 și 5 au fost produse prin procesul cunoscut sub numele de „pseudotipare” prin utilizarea respectivelor plasmide auxiliare pXYZ1 sau pXYZ5 (24), care conțin gene de capsidă AAV1 și respectiv AAV5. Vectorii au fost ambalați, purificați, concentrați și titrați așa cum este descris (24). Vectorii rAAV purificați au fost> 99% puri, măsurați prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă și colorare cu argint (datele nu sunt prezentate). Raportul mediu dintre particulele fizice și cele infecțioase a fost de 50: 1.

O doză unică de vector de 10 12 particule rezistente la DNază I la 500 μl de soluție Ringer lactată a fost administrată animalelor fie prin injecție venă portal (PVI), fie prin injecție în mușchiul cvadriceps.

Histologie. Șobolanii au fost uciși de supradozajul pentobarbital, iar serul a fost colectat. Întregul ficat a fost recoltat și cântărit. O mică porțiune a fost plasată în soluția ARNlaterală (Ambion, Austin, TX). Secțiuni de ficat, pancreas, țesut adipos și mușchi au fost recoltate pentru evaluare histopatologică de rutină. Probele de țesut au fost fixate în formalină tamponată neutră 10% peste noapte și încorporate în parafină. Secțiunile de parafină (5 μm grosime) au fost colorate cu hematoxilină și eozină și examinate pentru modificări inflamatorii sau degenerative de către un patolog care nu cunoștea grupul de tratament pentru animale.

Plasma Acrp30, Leptină și glucoză. Plasma Acrp30 a fost măsurată folosind kituri Acrp30 RIA de șoarece și șobolan (Linco Research Immunoassay, St. Charles, MO) sau kituri ELISA (B-Bridge International, Sunnyvale, CA). Alternativ, șoarecele Acrp30 a fost testat utilizând analiza Western blot (vezi mai jos). Leptina plasmatică a fost măsurată utilizând setul de panouri endocrine pentru șobolani LINCOplex (Linco Research Immunoassay).

i.p. Test de toleranță la glucoză (IP GTT). IP GTT a fost efectuat în săptămâna 27 după injectarea vectorului. După peste noapte 17-h rapid, șobolanii neanesteziați au fost injectați i.p. cu o doză de 1,5 g soluție de glucoză 50% pe kg de greutate corporală (BW). Probele de sânge au fost obținute din vena cozii înainte de provocarea glucozei și la 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după provocarea glucozei. Concentrația glicemiei a fost măsurată cu un contor portabil de glucoză Elite XL (Bayer, Elkhart, IN).

Izolarea ARN-ului. ARN-ul total din ficat a fost izolat utilizând reactiv TRIzol (GIBCO/BRL). Integritatea ARN a fost verificată prin denaturarea electroforezei cu gel de agaroză (1%) cu colorare cu bromură de etidiu.

Efectul rAAV1-Acrp30 sau rAAV5-Acrp30 administrat periferic la șobolani femele DIO. Toate injecțiile, cu excepția cazului în care se indică altfel, au fost făcute intraportal. (A) Modificarea BW. (B) FI medie zilnică afișată pentru toate grupurile. Două grupuri prezintă diferențe semnificative, după cum se indică. (C) Modificare în kcal/zi ingerată. Pentru claritate, sunt prezentate doar două grupuri de șobolani. (D) Aportul caloric mediu zilnic indicat pentru toate grupurile. (E) Nivelurile de leptină plasmatică la momentul uciderii animalelor. NS, nesemnificativ statistic. (F) Parcela de eficiență a hranei pentru animale (FE), așa cum se explică în Rezultate. □, șobolani martor DIO injectați cu vector rAAV-GFP (n = 10) și alimentați cu HF; ○, șobolani de control injectați cu vector rAAV-GFP (n = 6) și alimentați cu ND; •, șobolanii s-au injectat intramuscular cu vectorul rAAV1-Acrp30 (n = 6) și au alimentat HF; ▴, șobolani injectați cu vector rAAV1-Acrp30 (n = 6) și alimentați cu HF; ♦, șobolanii injectați cu vector rAAV5-Acrp30 (n = 6) și alimentați cu HF. Creșterea hranei ingerate și a caloriilor documentate la începutul experimentului (C) este atribuită trecerii la HF, care este mai plăcută. Săgețile din A și C indică ora când IP GTT a fost efectuat.

Analiza Western blot a proteinelor din plasmă de la șobolani injectați cu rAAV1-Acrp30 sau rAAV5-Acrp30. (A) Plasma de la șobolani în ziua 40 după tratament. (B) Plasma de la șobolani uciși în ziua 297 după tratament. (C) La fel ca B, cu excepția 1: 100 diluat și hibridizat cu anticorpi anti-Acrp30 specific șobolanului. Plasma de la șoarece normal a fost utilizată ca probă de control pozitiv (diluare 1: 100 sau 1: 200). Numerele de deasupra fiecărei benzi se referă la animale experimentale individuale. (D) SDS/4-15% PAGE electroforeză cu imunoblotare ulterioară. Înainte de încărcare, plasma prepurificată de la unul dintre șobolanii rAAV5-Acrp30 a fost tratată fie în condiții reducătoare (+), fie nereducătoare (-). Plasma diluată de la șoarece, utilizată ca control pozitiv, a fost tratată în același mod. Concentrația ridicată de proteine ​​în probe de șobolan nediluate în condiții nereducătoare a dus la o mobilitate ușor aberantă a complexelor multimerice; HMW, greutate moleculară mare; MMW, greutate moleculară medie; LMW, greutate moleculară mică (24).