Exenatida protejează împotriva disfuncției endoteliale induse de glucoză și lipide

Abstract

Introducere

Disfuncția endotelială joacă un rol crucial în dezvoltarea aterosclerozei și a evenimentelor cardiovasculare (1-3). Este prezent în diabetul de tip 2 (4,5) și este asociat cu concentrațiile postprandiale de glucoză din sânge și trigliceride (6-8). Atât hiperglicemia postprandială, cât și hipertrigliceridemia sunt ameliorate de agoniștii receptorilor GLP-1 (GLP-1R) (9-13), indicând potențialul acestor medicamente pentru diabet pentru a îmbunătăți funcția endotelială (EF).

În studiul nostru anterior, o singură injecție de exenatidă agonistă GLP-1R a inhibat creșterea post-masă a concentrațiilor de glucoză și trigliceride și a îmbunătățit EF după o singură masă bogată în grăsimi la subiecții cu toleranță la glucoză (IGT) afectată și cu diagnostic recent, controlat de dietă 2 diabet (14). Deși îmbunătățirea EF a fost similară la pacienții cu IGT și diabet, modelul modificării EF a apărut diferit și, în timp ce pacienții IGT au demonstrat o creștere absolută a vasodilatației postprandiale cu exenatidă, pacienții cu diabet au arătat o ameliorare a scăderii induse de masă a EF . Nu se cunoaște dacă exenatida poate îmbunătăți EF la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 pe parcursul meselor de zi ulterioare și dacă aceste beneficii vasculare ar fi prezente la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 cu durată mai lungă și poate cu disfuncție vasculară mai mare, este în mare parte necunoscut.

Deși am constatat că o parte a efectului exenatidei asupra EF a fost explicată de o reducere a concentrațiilor plasmatice de trigliceride (14), unele dintre îmbunătățirile induse de exenatidă ale EF au fost independente de reducerile glucozei și trigliceridelor plasmatice, susținând conceptul de vasorelaxare dependentă de endoteliu de către agoniști GLP-1R (15-24). Acțiunea vasculară directă a agonistului GLP-1R poate implica mai multe mecanisme. În timp ce studiile anterioare la rozătoare au implicat un rol al unei căi mediate non-GLP-1R activată în principal de produsele de degradare GLP-1 (19,20), date mai recente in vitro și in vivo indică o acțiune directă prin intermediul GLP-1Rs 22,24 endotelial. ). În sprijinul acestuia din urmă, mai multe căi de kinază cunoscute pentru a activa oxidul azotic endotelial (NO) sintază (eNOS) și a crește producția de NO sunt in vitro reglate în sus de diferiți agoniști GLP-1R (25-28). Cu toate acestea, care dintre aceste căi specifice postreceptorului ar putea explica efectul exenatidei asupra EF la om rămâne în mare parte necunoscut.

Pentru a clarifica aceste întrebări, am studiat 1) dacă exenatida are efecte favorabile asupra EF pe parcursul meselor secvențiale în diabetul de tip 2, 2) dacă aceste efecte apar și la pacienții cu diabet de tip 2 mai stabilit și 3) în ce măsură efectele exenatidei ar putea fi explicată prin acțiunea directă a exenatidei prin GLP-1Rs. În plus, am cercetat căi moleculare responsabile de acțiunea agonistă GLP-1R folosind arteriole umane și celule endoteliale.

Proiectare și metode de cercetare

Două studii randomizate, dublu-orb, încrucișate au fost aprobate de către comisia de revizuire instituțională. Toți subiecții au acordat consimțământul informat înainte de participare. Pacienții din ambele studii au primit doze stabile de tensiune arterială și medicamente pentru scăderea lipidelor timp de 3 luni înainte de înscriere.

Studiul 1

Studiul 2

Participanții cu IGT sau diagnosticați recent (am După măsurarea inițială a EF, cateterele au fost plasate în vena antecubitală (pentru perfuzie cu medicamente) și în vena mâinii dorsale (pentru prelevarea de sânge) a brațului dominant și, respectiv, nedominant. Șaizeci de minute după măsurarea inițială a EF, a fost inițiată o infuzie continuă (6000 pmol/L/kg) continuă (600 pmol/L/kg ⋅ min) de exendină-9 (Bachem, Bubendorf, Elveția) sau un volum echivalent de ser fiziologic. După 30 de minute, o perfuzie intravenoasă de s-a introdus exenatidă (50 ng/min) sau un volum echivalent de placebo. S-a demonstrat că această rată de perfuzie de exenatidă oferă o concentrație rapidă și stabilă similară cu concentrațiile maxime după injecțiile tipice de exenatidă subcutanată (30). Soluțiile au fost preparate printr-o cercetare- farmacist dedicat pentru a se asigura că personalul din studiu a rămas orb. Măsurarea EF a fost repetată 30 de minute în perfuzie cu exenatidă/placebo. Utilizarea intravenoasă a exendin-9 și exenatidă a fost aprobată în SUA . Food and Drug Administration IND 108.117 (J.K.). Probele de sânge pentru măsurarea glucozei și insulinei au fost luate înainte de fiecare etapă de perfuzie și cu 10 minute înainte de a doua măsurare EF, după care linia de prelevare a sângelui a fost retrasă pentru a evita posibile interferențe cu măsurarea EF.

Măsurarea EF

EF a fost evaluat prin tonometrie arterială periferică (PAT) (ENDO-PAT2000; Itamar Medical, Caesarea, Israel) așa cum s-a detaliat anterior (14). Răspunsurile pulsatile continue ale volumului de sânge de la ambele degete arătătoare au fost înregistrate pe parcursul unei perioade de echilibrare de 5 minute, o perioadă de 5 minute, incluzând umflarea suprasistolică a manșetei tensiunii arteriale pe brațul nedominant și o perioadă de 5 min de postinflație. Valorile indicelui reactiv de hiperemie (RHI) au fost normalizate la citirile din brațul contralateral. Coeficientul mediu de variație intrasubiect al măsurării RHI în laboratorul nostru este de 3% în aceeași zi secvențial și de 10% în două zile separate.

Studii în celulele endoteliale

Celulele endoteliale aortice umane (HAEC) și celulele endoteliale ale venei ombilicale umane (HUVEC) (Lonza; CC-2535 și respectiv CC-2517, Walkersville, MD) au fost menținute în mediu bazal endotelial (CC-3162; Lonza) suplimentat cu creșterea furnizată factori la 37 ° C într-un incubator umidificat suplimentat cu 5% CO2.

Pasajul 6-8 HAEC la confluența de 90-95% au fost tratați cu exendin-4 (adică exenatidă) cu sau fără pretratare cu compus inhibitor AMPK-C (CC) sau exendin-9 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), spălat cu PBS și lizat cu fosfatază adecvată și inhibitori de protează. AMPKα totală și fosforilată (situl de fosforilare Thr172), protein kinaza dependentă de AMPc (PKA, Thr197), Akt-kinaza (Ser473) și eNOS (Ser1177) au fost măsurate prin Western blots, folosind anticorpi de la Cell Signaling Technology (Beverly, MA) și normalizat la α-tubulină.

ARN-ul cu interferență specifică AMPKα1 (siRNAs) (TriFECTa Kit; IDT Inc., Coralville, IA) sau siRNA de control (IDT Inc.) au fost utilizate pentru a examina dacă AMPK a mediat efectele producției de NO. HUVEC-urile au fost utilizate pentru ușurarea transfecției utilizând reactivul de transfecție HiPerFect (Qiagen, Valencia, CA). Trecerea 3-5 celule la confluența 75-80% au fost transfectate timp de 24 de ore cu siRNA anti-AMPKα1 sau siRNA de control înainte de tratamentul cu 10 nmol/L exendin-4.

NO a fost măsurat utilizând diacetat de 4,5-diaminofluoresceină (DAF-2DA; Calbiochem, EMD Millipore, Billerica, MA). HAEC și HUVEC care au atins o confluență de 80% pe plăci cu 24 de godeuri au fost incubate cu 5 µmol/L DAF-2DA timp de 15 minute înainte de finalizarea tratamentului respectiv, spălate cu PBS (pH 7) și fixate în 4 % paraformaldehidă. Plăcile au fost fotografiate pe EVOS (Life Technologies, Grand Island, NY), iar intensitatea fluorescenței NO a fost analizată folosind ImageJ.

Studii de vasoreactivitate

Analize de laborator

Concentrațiile de glucoză plasmatică au fost măsurate la pat folosind un analizor de glucoză YSI 2700D (Yellow Springs, OH). Probele pentru alte măsurători în plasmă sau ser au fost depozitate la -80 ° C până la testarea lipidelor plasmatice (Abbott, Lake Forest, IL), insulinei plasmatice (EMD Millipore), apolipoproteinei B48 (apoB48; Biovendor, Asheville, NC) și acetaminofenului Immunalysis, Pomona, CA) și concentrațiile de d-xiloză (34).