Este necesară eliminarea concomitentă a cel puțin 20 de gene transportoare pentru a bloca captarea hexozelor în

Institutul de Microbiologie, Heinrich-Heine-Universität, Universitätsstr. 1, Geb. 26.12.01, D-40225 Düsseldorf, Germania

Abstract

Familia transportoare de hexoză a Saccharomyces cerevisiae cuprinde 18 proteine (Hxt1-17, Gal2). Aici, demonstrăm că toate aceste proteine, cu excepția Hxt12, și în plus trei membri ai familiei de transportoare de maltoză (Agt1, Ydl247, Yjr160) sunt capabili să transporte hexoze. Într-o tulpină de drojdie ștearsă pentru HXT1–17, GAL2, AGT1, YDL247w și YJR160c, consumul de glucoză și activitatea de transport au fost complet desființate. Cu toate acestea, ca o ștergere suplimentară a genei senzorului de glucoză SNF3 creșterea parțial restabilită pe hexoze, datele noastre indică existența a și mai multe proteine capabile să transporte hexoze în drojdie.

1. Introducere

Sursele de carbon preferate pentru majoritatea celulelor procariote și eucariote sunt glucidele, mai presus de toate glucozele monozaharidice. Această biomoleculă alcătuiește cea mai mare parte a materiei organice de pe pământ. Un pas obligatoriu și esențial în utilizarea glucozei este transportul acesteia prin membrana plasmatică în celule, un proces care este realizat de proteinele transportoare. Diferite mecanisme au evoluat în diferite organisme care mediază transportul glucozei, adică sisteme de simport de protoni, cotransportori de Na + -glucoză, sisteme dependente de proteine de legare, sisteme de fosfotransferază și sisteme de difuzare facilitate [1-3]. Unul dintre cele mai proeminente organisme care utilizează glucoza este drojdia Saccharomyces cerevisiae. Familia de permeaze de zahăr de drojdie este formată din 34 de proteine, dintre care 18 cuprind subfamilia transportor de hexoză [4-6] (Fig. 1). Deoarece transportul peste membrana plasmatică este un pas important în controlul ratei metabolismului glucozei, elucidarea funcțiilor acestei multitudini de proteine legate de transportorul de glucoză este o întrebare fundamental importantă. Mai mult, ar putea oferi informații despre principiile generale ale transportului glucozei și în alte organisme.

2. Materiale și metode

2.1 Tulpini de drojdie și condiții de creștere

Tulpinile de drojdie au fost descrise în Tabelul 1. Mediul și condițiile de creștere au fost cele descrise în [7]. Proprietățile de creștere au fost determinate pe mediu sintetic (sursă de carbon YNB + (NH4) 2SO4 +) suplimentată numai pentru cerințele auxotrofice.

Încordare	Genotip	Sursă
CEN.PK2‐1C (= VW1A)	MATα leu2‐3,112 ura3‐52 trp1‐289 his3 - Δ1 MAL2‐8 c SUC2 hxt17Δ	K.-D. Entian
EBY.VW367 +	CEN.PK2‐1C hxt13Δ: loxP hxt15Δ: loxP hxt16Δ: loxP hxt14Δ: loxP hxt12Δ: loxP hxt9Δ: loxP hxt11Δ: loxP hxt10Δ: loxP hxt8Δ: loxP hxt514Δ: loxP hxt2Δ: loxP	Acest studiu
EBY.VW1000	EBY.VW367 + hxt367Δ: loxP gal2Δ	Acest studiu
EBY.VW2000	EBY.VW1000 snf3Δ: loxP	Acest studiu
EBY.VW4000	EBY.VW1000 stl1Δ: loxP agt1Δ: loxP ydl247wΔ: loxP yjr160cΔ: loxP	Acest studiu
EBY.VW5000	EBY.VW4000 snf3Δ: loxP rgt2Δ: loxP	Acest studiu
EBY.FY100B	MATα ura3‐52 trp1Δ63 his3Δ200 (derivat din FY1679)	Acest studiu
EBY.FY367 +	EBY.FY100B hxt13Δ: loxP hxt15Δ: loxP hxt16Δ: loxP hxt17Δ: loxP hxt14Δ: loxP hxt12Δ: loxP hxt9Δ: loxP hxt11Δ: loxP hxt10Δ: loxP hxt8Δ: loxP hxt514Δ: loxP hxt2Δ: lox	Acest studiu

2.2 Construcția mai multor mutanți de deleție

Xthxt13/Δhxt17	5′‐ CGCACCACCCGTGGAAAAAGAGTGGTCAGATGGATTTGATGACAA CAGCTGAAGCTTCGTACGC ‐3 ′
5′‐ TTGAGAACTTCAAAAATTTCTTCCAATCCTTCTTCTCGGTCTTAC GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt15/Δhxt16	5′‐ ATGGCAAGCGAACAGTCCTCACCAGAAATTAATGCAGATAATCTAA CAGCTGAAGCTTCGTACGC ‐3 ′
5′‐ AGCATGTTTATCAAGCGCGCATATTGATCAATTAAAACTCTTTGGGAA GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Xthxt14	5′‐ GGCAGGGGAAGGGATTATAATGTAACCATTAAGTATCTAGATGAT CAGCTGAAGCTTCGTACGC ‐3 ′
5′‐ TCCTAGTTTGAAATCAATTTTGGATACAATCATTGGTGTTAAAAG GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Xthxt12	5′‐ ATCTTTGGTTGGGATACCGGTACCATTTCTGGTTTTGTTAACCTTTC CAGCTGAAGCTTCGTACGC ‐3 ′
5′‐ GGACAAAGAAAAAGACATAAAAGTATGCAAAAACCAGACAGCCTAAGA GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Xthxt11	5′‐ ATGTCAGGTGTTAATAATACATCCGCAAATGAGTTATCTACTACCATG TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ GGACAAAGAAAAAGACATAAAAGTATGCAAAAACCAGACAGCCTAAGA GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Xthxt10	5′‐ ATGGTTAGTTCAAGTGTTTCCATTTTGGGGACTAGCGCCAAGGCATCC TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ AATTATTTACTATCAACAATAACTAATGGTGTACTGCTTGTTGGTTGTGG GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Xthxt9	5′‐ GTAGCAAATGCACCATCTGTAAAAACTGAGCATAATGACTCTAAAAAC TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ GGACAAAGAAAAAGACATAAAAGTATGCAAAAACCAGACAGCCTAAGA GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Xthxt8	5′‐ ATGACTGATCGTAAAACCAACTTGCCAGAAGAACCGATTTTCGAAGAG TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ GGTCTAAAACATTCTTTTGTAGAAGGGTTTCTCGTCATGCTGTAATTT GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt5 - hxt1 - hxt4	5′‐ ATGTCGGAACTTGAAAACGCTCATCAAGGCCCCTTGGAAGGGTCTGCTACT TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ TTAGATCATCAGCGTTGTAGTCAGTACCTCTCTTGTTTGGTGGAACCAAG GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Xthxt2	5′‐ ATGTCTGAATTCGCTACTAGCCGCGTTGAAAGTGGCTCTCAACAAACT TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ TATTCCTCGGAAACTCTTTTTTCTTTTGGATCCAGCTACCAGAT GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt3 - hxt6 - hxt7	5′‐ ATGAATTCAACTCCAGATTTAATATCTCCACAAAAGTCAAGTGAGAATTCG TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ AAGTTTCTTTGTCTCCGTCCCACTCAACTTTCTGAGAACAAATGATC GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δstl1	5′‐ ATGAAGGATTTAAAATTATCGAATTTCAAAGGCAAATTTATAAGCAGA TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ ACCCTCAAAATTTGCTTTATCGTTCACTGTATCTTCATTTTTGATGTT GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δagt1/Δagt1: lacZ	5′‐ ATGAAAAATATCATTTCATTGGTAAGCAAGAAGAAGGCTGCCTCAAAA TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ TAATTCTCGCTGTTTTATGCTTGAGGACTGACTGATACTCTCATCAGC GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δydl247w/Δyjr160c	5′‐ ATGAAAAACTTATCTTTTCTCATAAACAGAAGAAAGGAAAATACAAGT TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ TTCCTCTGCAATGGAAGCTTCGATATCTCCCTTGGGGTCGTTATG GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δsnf3	5′‐ ATGGATCCTAATAGTAACAGTTCTAGCGAAACATTACGCCAAGAGAAA TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ TATTTCAAATCATTATTTTCATTTACAGGTTGATTAGTGGCGTTTTC GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
2rgt2	5′‐ ATGAACGATAGCCAAAACTGCCTACGACAGAGGGAAGAAAATAGTCAT TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ GGGGGAAGTGTATTGGCTGTGCTTACTAGCGAGGTCACTCGTCCAATT GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Omologie pentru genele transportoare de zahăr, îndrăznețe; omologie la kanMX casetă, italic.