Efectele neuroprotectoare și anti-oxidative ale hemodializatului Actovegin asupra neuronilor primari de șobolan în
Martin W. Elmlinger
1 Nycomed International Management GmbH, Thurgauerstrasse 130, 8152 Glattpark-Opfikon, Zurich, Elveția
Martin Kriebel
2 Institutul de Științe Naturale și Medicale, 72770 Reutlingen, Germania
Dan Ziegler
3 Institutul pentru Diabetologie Clinică, Centrul German pentru Diabet, Centrul Leibniz pentru Cercetarea Diabetului la Universitatea Heinrich Heine, Düsseldorf, Germania
4 Departamentul de Boli Metabolice, Spitalul Universitar, Düsseldorf, Germania
Abstract
Introducere
Polineuropatia simetrică distală diabetică (DPN) afectează aproximativ o treime din pacienții diabetici și este asociată cu morbiditate substanțială, inclusiv durere neuropatică dureroasă și ulcere ale piciorului care duc la amputare (Ziegler și colab. 2008; Boulton și colab. 2005). Analgezicele sunt eficiente în tratamentul durerii neuropatice (Dworkin și colab. 2007), dar nu încetinesc progresul neuropatiei subiacente (Boulton și colab. 2005). Au fost dezvoltate diverse abordări terapeutice pentru tratarea DPN (Cameron și colab. 2001), care abordează patologia tulburării, mai degrabă decât doar ameliorează durerea (Ziegler și colab. 1995; Boulton și colab. 2005; Chalk și colab. 2007). Cu toate acestea, în ciuda progreselor recente aparente, o terapie durabilă puternică a DPN rămâne în continuare o nevoie medicală nerezolvată.
Actovegin, un hemodializat deproteinizat produs din sânge de vițel, care conține compuși cu greutate moleculară mică de până la 5.000 Da, sa dovedit a avea beneficii terapeutice substanțiale în DPN. Recent, un studiu randomizat, dublu-orb, controlat cu placebo, cu tratament secvențial intravenos și actovegin oral pe 567 de pacienți cu DPN a fost efectuat pe o perioadă de 160 de zile (Ziegler și colab. 2009). Tratamentul cu Actovegin a îmbunătățit semnificativ simptomele neuropatice, cum ar fi pragul de percepție a vibrațiilor, funcția senzorială și calitatea vieții pacienților cu DPN. Hemodializatul este aprobat ca medicament (Actovegin ®) în mai multe țări și se aplică pentru tratarea polineuropatiei diabetice și a altor boli (pentru revizuire a se vedea: Buchmayer și colab. 2011).
Scopul prezentei investigații a fost de a elucida efectele celulare, prin care actovegina își poate exercita efectele terapeutice benefice în DPN. Acțiunile farmacologice cunoscute ale actoveginei sunt stimularea absorbției oxigenului, utilizarea oxigenului și metabolismul energiei celulare (Obermaier-Kusser și colab. 1989; Buchmayer și colab. 2011). Mai mult, exercită activitate asemănătoare insulinei, cum ar fi stimularea transportului glucozei, piruvat dehidrogenazei și oxidării glucozei (Jacob și colab. 1996). Datorită acestor proprietăți, actovegina a fost utilizată anterior pentru tratarea tulburărilor vasculare și degenerative cerebrale (Kanowski și colab. 1995; Herrmann și colab. 1992). În plus, hemodializatele administrate sub formă de perfuzii au arătat efecte benefice asupra semnelor clinice ale demenței (Schlaffer și colab. 1991; Beiswenger și colab. 2008), care pot indica efecte regenerative asupra țesutului neuronal.
Materiale și metode
Pregătirea culturilor neuronale
Culturile disociate de neuroni hipocampici de șobolan au fost preparate conform unui protocol standard (Maar și colab. 1997). Țesutul hipocampic din fetuții de șobolani embrionari din ziua 18 a fost colectat în soluție sterilă de sare echilibrată Hanks [tampon HBSS [Invitrogen, Karlsruhe, Germania] conținând HEPES 7 mM, pH 7,3) și tripsinizat utilizând 1 × tripsină - EDTA (PAA, Pasching, Austria) conținând 10 mM HEPES, pH 7,3. Mediul fără ser și condițiile de cultură au fost adaptate pentru creșterea celulelor neuronale pentru a minimiza creșterea contaminării altor tipuri de celule gliale. Combinația de colorare nucleară și microscopie cu contrast de fază a asigurat că numărul de celule numărate reflectă modificări ale numărului de celule neuronale. Ulterior, țesutul a fost triturat în tampon HBSS - HEPES până când nu s-au văzut aglomerări de țesut. Numărul de celule a fost determinat și 2 × 104 celule/godeu au fost însămânțate în 100 μl mediu NMEM-B27 (Burkarth și colab. 2007; Goetze și colab. 2003) în plăci cu 96 de godeuri acoperite cu poli-l-lizină (Greiner Bio- Unul, Frickenhausen, Germania) și cultivat la 37 ° C și 5% CO2.
Actovegin Tratamentul neuronilor hipocampici de șobolan
Neuronii hipocampici de șobolan au fost tratați cu doze crescânde (0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1.000 μg/ml) de actovegină (Actovegin®, Nycomed, Linz, Austria) prin adăugarea a 50 μl de soluție stoc prediluată la culturi, la 5 ore după placare. A fost testată o gamă largă de doze, deoarece nu a fost posibilă definirea unei doze care se referă la doza aplicată în terapia pacienților cu diabet zaharat. Celulele au fost cultivate la 37 ° C și 5% CO2 într-o atmosferă umidificată. Efectele tratamentului cu Actovegin au fost explorate în ceea ce privește menținerea culturii și conectivitatea sinaptică, creșterea neuritei și neuroprotecția (adică protecția împotriva apoptozei induse de Aβ25-35). Mai mult, protecția prin actovegină de stresul oxidativ (nivelurile ROS) a fost testată la neuronii de șobolan.
Imunocitochimie
Pentru etichetarea imunocitochimică a dendritelor cu anticorpi împotriva proteinei 2 asociate microtubulilor (MAP2; în zilele 3 și 6 ale culturii in vitro) pentru a fi utilizate în analiza ulterioară a creșterii neuritei și a sinapselor excitatorii (Vesicular Glutamate Transporter 1 (VGlut1); ziua 10 ) în scopul evaluării conectivității sinaptice, neuronii hipocampici cultivați au fost fixați cu 4% paraformaldehidă în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) timp de 15 minute la temperatura camerei.
Celulele au fost spălate o dată cu PBS și apoi blocate și îmbibate cu reactiv de blocare (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania) conținând 0,2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania) timp de 1 oră la temperatura camerei. Anticorpii primari împotriva proteinei 2 asociate microtubulilor (MAP2; Sigma-Aldrich) și a transportorului glutamat vezicular 1 (VGlut1; Synaptic Systems, Göttingen, Germania) au fost diluați [1: 1.000] în reactiv de blocare conținând 0,2% Triton X-100 și incubat cu celulele la 4 ° C peste noapte. Celulele au fost spălate cu PBS și anticorpii primari au fost detectați cu IgG de capră anti-șoarece conjugat cu Cy3 (diluat 1: 600; Dianova, Hamburg, Germania) în timpul unei incubări de 2 ore la temperatura camerei. Nucleele au fost colorate cu Hoechst 33258 (1 mg/ml; Invitrogen GmbH, Darmstadt, Germania). Concentrația de lucru de 1 μg/ml a fost atinsă printr-o diluție de 1: 1.000 în PBS. Celulele au fost spălate și depozitate la 4 ° C până la examinarea prin microscopie cu fluorescență. Achiziția de imagini a fost efectuată pe un Zeiss Axiovert 200.