DSCAM-AS1 promovează creșterea tumorii a cancerului de sân prin reducerea miR-204-5p și reglarea în sus a RRM2

Găsiți acest autor pe Google Scholar
Găsiți acest autor pe PubMed
Căutați acest autor pe acest site
Record ORCID pentru Na Li
Pentru corespondență: [email protected]

Abstract

Declarație sumară Analiza microarray și qRT-PCR au fost utilizate pentru a determina expresia DSCAM-AS1 și miR-204-5p în BC. DSCAM-AS1 a promovat proliferarea și afectarea apoptozei celulelor BC prin reducerea miR-204-5p și îmbunătățirea expresiei RRM2.

Introducere

Cancerul de sân (BC) este o afecțiune malignă obișnuită în întreaga lume și peste 370.000 de femei mor în fiecare an din cauza BC în întreaga lume (Wang și colab., 2017). Principala cauză a morbidității și mortalității BC este o boală metastatică incurabilă, care este foarte rezistentă la terapiile tradiționale (Xu și colab., 2017). În ciuda progreselor în diagnostic și terapie, cum ar fi chirurgia, chimioterapia și radiațiile, există rate ridicate de recurență și metastază în rândul pacienților cu BC (Wang și colab., 2015). În plus, tratamentul continuu cu radioterapie și chimioterapie duce la distrugerea mai puțin eficientă a celulelor canceroase datorită rezistenței dobândite (Vimalraj și colab., 2013). Prin urmare, mecanismele moleculare care stau la baza tumorigenezei BC trebuie investigate în continuare.

ARN-urile necodificate lungi (ARNc) sunt definite ca transcrieri care au mai mult de 200 de nucleotide și nu au capacitate de codificare a proteinelor (Xu și colab., 2017). S-a raportat că ARNc-urile implică progresia tumorii și metastaza prin reglarea diferitelor niveluri ale proceselor biologice, cum ar fi splicarea alternativă a ARNm, activitățile proteice, modificările localizării proteinelor etc. (Huarte, 2015; Xu și colab., 2017). Un număr tot mai mare de literaturi a raportat că ARNc-urile sunt strâns legate de cancerul uman și sunt implicate în controlul disponibilității pentru miARN specifice (Bartonicek și colab., 2016). În BC, au fost raportate o serie de ARNc-uri exprimate diferențial și corelația lor cu funcțiile tumorigenice (Xi și colab., 2017; Yan și colab., 2017; Zhou și colab., 2017). De exemplu, lncFOXO1 a fost în mod special reglementat în jos în BC și a inhibat creșterea BC prin creșterea transcripției FOXO1 (Xi și colab., 2017). În timp ce, linc-ITGB1 a fost foarte mult reglementat în BC, ceea ce a favorizat metastaza celulară (Yan și colab., 2017).

DSCAM (Down Syndrome Cell Adhesion Molecule) antisens lncRNA (DSCAM-AS1), situat pe 21q22.2, este transcris din catena antisens a DSCAM aparținând superfamiliei de imunoglobulină a moleculelor de adeziune celulară (Zhao și colab., 2014). Mai multe literaturi au raportat că DSCAM-AS1 este asociat cu progresia celulelor canceroase (Miano și colab., 2016; Niknafs și colab., 2016; Zhao și colab., 2014). Zhao și colab. a constatat că DSCAM-AS1 a fost supraexprimat în adenocarcinomul pulmonar și ar putea interacționa cu genele lor gazdă pentru a îndeplini funcția diferitelor subtipuri de cancer pulmonar (Zhao și colab., 2014). Miano și colab. a descoperit că supraexpresia DSCAM-AS1 a promovat creșterea unei linii celulare luminale de cancer de sân (Miano și colab., 2016). De remarcat, Yashar S și colab. a arătat că DSCAM-AS1 ar putea interacționa cu hnRNPL pentru a media progresia tumorii (Niknafs și colab., 2016). Cu toate acestea, întreaga poveste despre modul în care creșterea și progresia luminală a cancerului de sân mediată de DSCAM-AS1 rămâne în mare parte necunoscută. Prin urmare, este necesară o înțelegere suplimentară a țintelor și rețelelor reglementate de DSCAM-AS1.

Ribonucleotida reductază M2 (RRM2) este subunitatea catalitică a ribonucleotide reductazei, care este o enzimă esențială implicată în sinteza ADN și poate regla activitatea enzimatică a acesteia (Iwamoto și colab., 2015). Mai multe publicații au raportat că RRM2 a fost supraexprimat în diverse celule canceroase (Zhong și colab., 2016). Disregularea RRM2 în BC a fost investigată anterior în unele literaturi. De exemplu, RRM2 a fost supus reglării în celulele BC și ar putea acționa ca un marker critic pentru BC agresiv (Lu și colab., 2012). Shah și colab. a constatat că inhibarea RRM2 a suprimat creșterea tumorilor in vivo și a scăzut celulele migratoare și invazive în BC (Putluri și colab., 2014). Mai multe studii au indicat rolul RRM2 ca țintă a miARN în cancerele umane. Rezultatele experimentelor noastre au clarificat mecanismul de reglare între RRM2 și miR-204-5p.

În studiul actual, am măsurat nivelul de expresie al DSCAM-AS1 și miR-204-5p în celulele BC. Ulterior, am folosit un sistem de raportare dual-luciferază pentru a verifica corelația DSCAM-AS1 și miR-204-5p. Ulterior, efectele DSCAM-AS1 asupra proliferării BC, metastazelor de creștere și apoptozei au fost măsurate printr-o serie de experimente in vitro incluzând testul apoptozei celulare, testul CCK-8 și testul transwell și experimentele in vivo. În plus, am explorat și impactul RRM2 asupra activităților celulelor BC și asupra creșterii tumorii. Aceste rezultate au evidențiat faptul că DSCAM-AS1 poate fi o strategie terapeutică promițătoare pentru tratamentul BC uman.

Materiale și metode

Exemplare de țesut

Țesuturile BC și țesuturile adiacente au fost colectate între ianuarie 2014 și august 2015 de la 40 de pacienți ai Spitalului Centrului Afiliat, Universitatea de Medicină Xinxiang. Toate exemplarele au fost colectate de la femei cu vârste cuprinse între 44 și 71 de ani (vârsta medie: 62,3). Pacienții nu au primit chimioterapie sau radioterapie înainte de operație. Toate probele de țesut au fost verificate independent de trei patologi sau medici înainte de a se păstra în azot lichid la -80 ° C sau de a transfera în tuburi de microcentrifugă care conțin reactiv TRIzol pentru extracția ARN. Caracteristicile relevante ale acestor 40 de pacienți sunt descrise în Tabelul 1. Toate experimentele au fost efectuate cu consimțământul informat al pacienților și sub aprobarea Spitalului Centrului Afiliat, Universitatea Medicală Xinxiang.

Caracteristicile clinice și patologice ale subiecților studiați

Cultură de celule

Linia celulară de cancer mamar uman HCC1937 și linia celulară de rinichi embrionar uman HEK293 au fost achiziționate de la banca de celule a Academiei Chineze de Științe (Shanghai, China). Celulele HCC1937 au fost cultivate în mediu RPMI-1640 (GIBCO, Grand Island, NY, SUA) plus 10% (v/v) ser bovin fetal (FBS), 1,5 g/L de NaHCO3, 2,5 g/L glucoză, 0,11 g/L piruvat de sodiu și 1% (v/v) penicilină-streptomicină. Celulele HEK293 au fost menținute în mediu DMEM suplimentat cu 10% (v/v) FBS ȘI 1% (v/v) penicilină-streptomicină.

Analiza microarray

Datele despre țesutul tumorii mamare au fost colectate din baza de date TCGA. Pachetul R „DESeq2” a fost utilizat pentru a normaliza, identifica și vizualiza miARN și lncRNA exprimate diferențial (log2 | Fold Change |> 1 și s-a folosit metoda P.adjust - ΔΔCt pentru a cuantifica valorile relative ale expresiei ARNm. Sunt prezentate exemplele specifice utilizate în tabelul 2.

Exemple de secvențe pentru qRT-PCR

Western blot

Probele de proteine au fost lizate în tampon RIPA (Beyotime, Shanghai, China) cu un cocktail de inhibitor de protează (Roche, Basel, Elveția). După centrifugare, concentrația de proteine supernatante a fost măsurată cu reactivul Bradford (Bio-Rad, CA, SUA). După eluare cu tampon de încărcare SDS, proteinele au fost electroforizate în gel de electroforeză gel SDS-poliacrilamidă 10% (SDS-PAGE), transferate în membranele nitrocelulozice (Millipore, SUA) și blocate. Au fost adăugați anticorpi primari (anti-RRM2, ab172476, 1: 2000; anti-GAPDH, ab181603, 1: 10000, Abcam, Cambridge, MA, SUA). După ce s-a spălat extensiv cu TBST, s-a adăugat anti-corp secundar (capră anti-iepure IgG H&L (HRP), ab6721, 1: 2000, Abcam, Cambridge, MA, SUA) timp de 1,5 ore. Detectarea semnalului a fost efectuată prin imunoblotare cu un sistem ECL (Life Technology, SUA). Pentru cuantificarea relativă, am normalizat nivelul de expresie GADPH (ca nivel de gri) la 1 și am comparat nivelurile de expresie (nivel de gri) ale diferitelor grupuri experimentale prin intermediul software-ului ImageJ.