Disocierea indusă de suprafață a complexelor de proteine noncovalente într-o gamă extinsă de masă Orbitrap
Zachary L. VanAernum
un Departament de Chimie și Biochimie, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus Ohio 43210, SUA.
Joshua D. Gilbert
un Departament de Chimie și Biochimie, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus Ohio 43210, SUA.
Mihail E. Belov
b Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germania
Alexander A. Makarov
b Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germania
Stevan R. Horning
b Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germania
Vicki H. Wysocki
un Departament de Chimie și Biochimie, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus Ohio 43210, SUA.
J.D.G: Thermo Fisher Scientific Inc., 5350 NE Dawson Creek Dr., Hillsboro, Oregon 97124.
Date asociate
Abstract
Abstract grafic
Introducere
Disocierea indusă de suprafață (SID) a apărut ca o metodă puternică de activare bazată pe coliziune pentru sondarea structurilor complexe proteice în faza gazoasă, producând fragmentarea care oferă informații complementare care au obținut din metodele de activare menționate anterior. 27 În loc să supună ionii la mai multe coliziuni cu energie redusă cu gazul de fundal, SID experimentează ionii direct într-o suprafață inertă și rigidă pentru a transmite energie analitului într-o singură etapă cu energie ridicată. SID are ca rezultat, în general, o partiționare mai simetrică a sarcinii în subcomplexele produse în raport cu CID 28 și UVPD. 26 După cum sa observat folosind instrumente de mobilitate ionică (IM) -MS, subcomplexele generate prin SID sunt, în general, compacte după disociere, cu secțiuni transversale de coliziune care reflectă structurile (sub) biomoleculare. În plus, SID al complexelor proteice legate de ligand duce adesea la subcomplexe cu liganzi reținuți în buzunarul de legare, ceea ce nu este adesea cazul CID. 30,31 Aceste caracteristici fac din SID un instrument util pentru sondarea complexelor biomoleculare fără structuri rezolvate. 32–34
Până de curând, lucrările care implică SID ale complexelor proteice au fost în mare parte efectuate pe platformele TOF. 35.36 Odată cu utilizarea tot mai mare a MS native pentru caracterizarea structurală a complexelor proteice, a devenit evident că o rezoluție mai mare a masei este deseori de dorit și permite o perspectivă mai profundă asupra unui sistem biologic dat. De exemplu, măsurarea deplasărilor de masă rezultate din modificări post-translaționale și/sau legarea liganzilor mici sau a cofactorilor devine posibilă la nivelul complexului proteic la o rezoluție suficientă. 37.38 Fiecare tip de analizor de masă (TOF, FT-ICR, Orbitrap) are avantaje și dezavantaje, iar alegerea instrumentului va depinde adesea de întrebarea abordată. Grupul nostru a demonstrat recent SID pe o platformă FT-ICR, obținând o rezoluție de masă fără egal a subcomplexelor generate de SID. 39 Cu toate acestea, credem că metodele de activare, cum ar fi SID, ar trebui să fie neutre pentru furnizor și platformă și că SID pe platformele Orbitrap optimizate pentru o gamă crescută de m/z vor fi, de asemenea, benefice pentru utilizatorii de spectrometrie de masă.
Sectiunea Experimentala
Proiectare dispozitiv SID
(A) Desen tehnic al dispozitivului SID cu suporturi de montare. (b) O descriere simplificată în secțiune transversală a dispozitivului SID care prezintă o traiectorie ionică de la dreapta la stânga în modul SID. (c) O diagramă a platformei EMR modificate cu dispozitivul SID prototip instalat între quadrupol și C-trap.
Fabricarea dispozitivului a fost realizată intern de către departamentul de mașini al Departamentului de Chimie și Biochimie al OSU, folosind aluminiu pentru toți electrozii și polimerul polieter eter cetonă (PEEK) pentru a monta și a spaționa corect electrozii. Calea ionică originală rămâne neobstrucționată pentru a permite un impact minim asupra experimentelor numai MS (adică fără activare), precum și experimentelor CID (HCD). Când se dorește SID, electrozii frontali ai dispozitivului SID sunt reglați pentru a direcționa ionii către suprafața din partea superioară a dispozitivului. O descriere detaliată a suprafeței utilizate pentru coliziuni poate fi găsită în altă parte. 35 Pe scurt, o suprafață de sticlă a fost acoperită cu un strat de titan de 10 Å, un strat de aur de 1000 Å și apoi modificată cu un monostrat auto-asamblat cu fluorocarbon. Desenele detaliate și tensiunile aplicate dispozitivului SID pot fi găsite în Figura S1.
Spectrometrie de masa
Materiale
Rezultate si discutii
Streptavidin
Streptavidina servește ca sistem model pentru experimentele SID. Este un homotetramer simetric D2 de 53 kDa, format din subunități dispuse ca un dimer de dimeri (Figura 2a). La activarea prin CID, streptavidina tetramer se disociază în monomeri foarte încărcați și trimeri cu încărcare relativ scăzută (Figura S3). 44 Acest comportament în care o subunitate se desfășoară și ia cu sine o cantitate disproporționat de mare de sarcină este tipic pentru CID datorită procesului său de depunere a energiei cu mai multe etape. 16–18 Important, acest rezultat de disociere de la CID nu acceptă dimerul cunoscut al aranjamentului subunității dimerilor. În schimb, lucrările anterioare au arătat că SID de streptavidin tetramer are ca rezultat producerea de dimeri la energie scăzută și monomeri la energie ridicată, în concordanță cu zonele de interfață și geometria complexă determinată de structura cristalină. 30