Dieta influențează profilurile bacteriene și de acizi grași liberi ai cuticulei Galleria mellonella

Roluri Conceptualizare, Investigație, Metodologie, Vizualizare, Scriere - schiță originală

profilurile

Afiliere Institutul de parazitologie Witold Stefański Academia Poloneză de Științe, Twarda, Polonia

Roluri Curarea datelor, validare

Afiliere Institutul de parazitologie Witold Stefański Academia Poloneză de Științe, Twarda, Polonia

Roluri Arhivarea datelor, Investigații

Afiliere Institutul de parazitologie Witold Stefański Academia Poloneză de Științe, Twarda, Polonia

Roluri Administrare proiect, supraveghere

Afilieri Institutul de Parazitologie Witold Stefański Academia Poloneză de Științe, Twarda, Polonia, BIOMIBO, Varșovia, Polonia

  • Michalina Kazek,
  • Agata Kaczmarek,
  • Anna Katarzyna Wrońska,
  • Mieczysława Irena Boguś

Cifre

Abstract

Citare: Kazek M, Kaczmarek A, Wrońska AK, Boguś MI (2019) Dieta influențează profilurile bacteriene și de acizi grași liberi ai cuticulei larvelor Galleria mellonella. PLoS ONE 14 (2): e0211697. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211697

Editor: Fabio S. Nascimento, Universitatea din Sao Paulo Facultatea de Filosofie a Științelor și Literelor din Ribeirao Preto, BRAZILIA

Primit: 4 iulie 2018; Admis: 19 ianuarie 2019; Publicat: 7 februarie 2019

Disponibilitatea datelor: Toate datele care stau la baza studiului se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Această lucrare a fost parțial susținută de grantul Centrului Național pentru Cercetare și Dezvoltare POIG.01.04.00-14-019/12 către MIB și de către Oficiul Marshal’s of Mazowieckie Voivodeship grant RPMA.01.02.00-14-5626/16. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Insectele cuprind cea mai numeroasă și răspândită clasă de animale. Importanța lor pentru viața de pe pământ este imensă: joacă un rol important în circulația și distribuția materiei organice, participă la reproducerea plantelor prin polenizare și fac parte din dieta multor animale vertebrate. Cu toate acestea, în ciuda beneficiilor oferite de unele specii, multe altele sunt considerate dăunători sau vectori ai diferitelor boli [1-3].

Molia ceara cea mai mare, Galleria mellonella (ordinul Lepidoptera) este un membru al subfamiliei Galleriinae din familia Pyralidae [13]. Este un dăunător omniprezent al a două specii de albine: Apis mellifera și Apis cerana, în special în regiunile tropicale și subtropicale. Molia pătrunde mai întâi în stupii lor, după care larvele sale sapă în celulele care conțin polen, puietul de albine și miere, rezultând daune grave stupului și populației de albine; de fapt, se crede că molia ceara mai mare este unul dintre factorii care contribuie la declinul populațiilor de albine domestice și sălbatice.

Cu toate acestea, larvele de G. mellonella au fost folosite recent ca alternativă la vertebrate ca gazde model pentru studierea microorganismelor patogene [14-16]. Larvele oferă multe avantaje ca model de gazdă. Cel mai important, acestea pot fi menținute la 37 ° C, permițând astfel studierea microorganismelor în condițiile de temperatură la care sunt patogene pentru gazdele umane. În plus, acestea permit utilizarea mai multor opțiuni pentru administrarea facilă a agentului patogen: injecție, administrare orală sau aplicare topică. Larvele de G. mellonella sunt, de asemenea, ieftine și ușor de întreținut. În plus, această specie este cunoscută ca fiind susceptibilă la 29 de specii de ciuperci, șapte viruși, o specie de parazit și 16 toxine biologice [16].

Scopul principal al acestui studiu a fost de a determina dacă susceptibilitatea la infecții fungice demonstrată de două populații de larve de ceai mai mare (G. mellonella), adică una menținută pe o dietă naturală și cealaltă hrănită cu o dietă semi-artificială, este corelată cu profilurile lor cutanate de FFA, astfel cum se determină prin tehnica GC/MS. Studiul examinează, de asemenea, microflora bacteriană pe cuticula ambelor populații de G. mellonella. Un element important semnificativ al cercetării noastre este că aceasta este prima examinare a influenței dietei asupra rezistenței G. mellonella la ciuperci entomopatogene. Acest studiu nu numai că oferă informații importante în domeniul fiziologiei insectelor și al imunologiei insectelor, ci reprezintă, de asemenea, o referință utilă pentru studiile viitoare.

Materiale și metode

Ciuperca Conidiobolus coronatus

C. coronatus (Entomopthorales), izolat numărul 3491, inițial izolat din Dendrolaelaps spp., A fost primit din colecția Prof. Bałazy (Academia Poloneză de Științe, Centrul de Cercetare pentru Mediul Agricol și Forestier, Poznań).

Coloniile fungice au fost cultivate în mod obișnuit în cutii Petri de 90 mm pe mediu de agar Sabouraud. Au fost incubați la 20 ° C sub o fotoperioadă de 12 ore (L: D 12:12) pentru a stimula sporularea [17]. Larvele omogenizate de G. mellonella au fost adăugate la mediu la o concentrație finală de 10% în greutate umedă (SAB-GM) pentru a crește virulența. Coloniile fungice utilizate pentru experimente au fost cultivate timp de șapte zile.

Insecte

Două culturi de molii de ceară, G. mellonella (Pyralidae, Lepidoptera), au fost crescute în camere de sticlă la 30 ° C, 70% umiditate relativă și în întuneric constant. Un grup a fost menținut pe o dietă semi-artificială compusă din făină de grâu, tărâțe de grâu, lapte uscat, făină de porumb, drojdie uscată, glicerină, miere și apă, așa cum este descris de Sehnal [18] Insectele din al doilea grup au fost crescute sub aceleași condiții optime de creștere, dar au fost hrănite cu ceară naturală de albine luată din stupi naturali. În fiecare grup, cel puțin cinci generații au fost crescute în aceste condiții. După ce au ajuns la ultimul (al șaptelea) stadiu, după ce au încetat să se hrănească înainte de a intra în metamorfoză (larvele de ultimul stadiu de 5 zile, 5DL7), larvele au fost cântărite și utilizate în experimente.

Larvele 5DL7 hrănite în mod natural și semi-artificial au fost expuse timp de 24 de ore la colonii C. coronatus complet crescute și sporulante. Aproximativ 15 indivizi au fost menținuți în fiecare cutie Petri și s-a format un grup de control din larve expuse timp de 24 de ore la SAB-GM steril. Aceasta s-a dovedit a fi cea mai eficientă metodă de infecție, fiind una care seamănă cel mai mult cu procesul natural de infecție [19]. După expunere, insectele au fost transferate în vase Petri noi, curate, cu alimente adecvate și dezvoltarea lor ulterioară a fost inspectată zilnic. Insectele destinate extracțiilor lipidice cuticulare au fost înghețate și menținute la -80 ° C până la analiză.

Identificarea bacteriilor

Pentru a identifica bacteriile prezente pe cuticula G. mellonella, cinci larve și 100 ml de soluție salină tamponată cu fosfat steril (PBS) au fost colectate într-un balon steril de 250 ml și agitate timp de 10 minute. După acest timp, 500 μl din suspensie au fost luate și cultivate pe cutii Petri cu Agar Columbia suplimentat cu 5% sânge de oaie. Coloniile au fost incubate timp de 24 de ore la 30 ° C (condiții optime de creștere pentru larvele G. mellonella). Pentru fiecare cultură, au fost efectuate cinci repetări independente. În etapa următoare, coloniile bacteriene unice au fost izolate și cultivate pe noi cutii Petri cu Agar Columbia cu 5% sânge de oaie. Din nou, vasele au fost incubate timp de 24 de ore la 30 ° C. Pentru selecție preliminară, s-a efectuat colorarea Gram. Examinarea microscopului a fost efectuată folosind un microscop Axio Vert A1 (Zeiss) și achiziția de imagini cu software-ul Zen (Zeiss).