Deficitul de vitamina A promovează hiperreactivitatea bronșică la șobolani prin modificarea receptorului muscarinic M2

Departamentul Serviciului de Cercetare a Afacerilor Veteranilor și Departamentele

Medicina Interna si

Departamentul Serviciului de Cercetare a Afacerilor Veteranilor și Departamentele

Medicina Interna si

Radiologie, Universitatea din Iowa Colegiul de Medicină, Iowa City, Iowa 52242

Departamentul Serviciului de Cercetare a Afacerilor Veteranilor și Departamentele

Medicina Interna si

Abstract

Hiperreactivitatea bronșică prelungită (BHR) este o consecință prelungită a infecției acute a tractului respirator. Este deosebit de important la persoanele cu astm, dar este evident și la persoanele fără astm (49). BHR poate urmări infecția căilor respiratorii inferioare (bronșiolită respiratorie indusă de virusul sincițial) sau rinita și faringita care sunt produse de rinovirus. Ipotezăm că VAD ar putea contribui la excesul de morbiditate și mortalitate prin infecții ale tractului respirator prin creșterea sau prelungirea BHR. Pentru a începe abordarea acestei ipoteze, am studiat șobolanii cu VAD, în absența infecției respiratorii, pentru a determina dacă VAD în sine este asociat cu BHR.

Alții au demonstrat că o scădere a funcției receptorului muscarinic contribuie la BHR în timpul răspunsului la un antigen sensibilizant sau după infecția respiratorie virală (1). Receptorul muscarinic M2 (M2R) este un important regulator al rezistenței căilor respiratorii și funcția sa este modificată de o varietate de afecțiuni inflamatorii. M2R acționează ca autoreceptoare și suprimă semnalizarea muscarinică după contracția colinergică a mușchiului neted al căilor respiratorii prin diminuarea eliberării de acetilcolină din veziculele prejunctionale din mușchiul neted (9). Aceasta limitează disponibilitatea acetilcolinei, care poate stimula receptorii M3 muscarinici postjunctionați (M3R) pe celulele musculare netede bronșice și induce contracția musculaturii netede a căilor respiratorii. Funcția M2R este diminuată în astm, ceea ce duce la o scădere a calibrului bazei căilor respiratorii și hiperreactivitate la bronhoconstrictoare (14).

Următoarele studii demonstrează că șobolanii cu VAD sunt mai receptivi la metacolină, un agonist muscarinic, decât șobolanii care au fost menținuți pe o dietă suficientă cu vitamina A (VAS). În conformitate cu această constatare, șobolanii cu VAD demonstrează o scădere a proteinei M2R bronșice și a funcției.

Pregătirea șobolanilor VAD.

Analiza BHR.

Distanță de 99m Tc-DTPA din spațiul aerian.

Analize histologice ale grosimii peretelui căilor respiratorii.

În momentul eutanasiei, plămânul stâng a fost spălat și umflat cu paraformaldehidă 4% în fosfat de sodiu 0,1 M, pH 7,0, timp de 6 ore. Plămânii fixi au fost tăiați sagital lângă hil în secțiuni de 3 mm, deshidratați și încorporați în parafină. Blocurile de parafină au fost secționate la intervale de 3,5 μm și colorate cu hematoxilină și eozină. Secțiunile au fost inițial fotografiate folosind un microscop Olympus BX40 și diapozitive de 35 mm au fost pregătite și scanate folosind un scaner Nikon. Imaginile digitalizate au fost analizate folosind programul Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Bronhiile care au prezentat un cerc închis sau un profil oval au fost selectate pentru a cuantifica grosimea peretelui bronșic (2). Perimetrele definite de membrana bazală subepitelială și marginea periferică a peretelui exterior al adventiției au fost urmărite electronic. Aria peretelui bronșic total a fost calculată ca diferență între aria definită de perimetrul adventitial și aria definită de perimetrul luminal (33). Acest instrument analitic corectează variabilitatea grosimii peretelui într-o anumită secțiune. Zona peretelui a fost împărțită de circumferința membranei bazale subepiteliale pentru a se normaliza pentru variația dimensiunilor căilor respiratorii (6).

Evaluarea fiziologică a funcției M2R.

Imunoblotare pentru M2R și M3R.

Pentru a demonstra că anticorpii au fost specifici pentru țintele proteice preconizate, s-au folosit peptide blocante. Aceștia au fost incubați cu anticorpii lor respectivi înainte ca anticorpul să fie adăugat la proteinele bronșice imobilizate. Peptidele au fost unice pentru M2R sau M3R și au fost peptide imunizante care au fost utilizate pentru a produce anticorpii anti-M2R și, respectiv, anti-M3R. Condițiile pentru SDS-PAGE și imunoblotarea au fost identice cu cele descrise mai sus.

Analize statistice.

Valorile sunt medii ± SE. Penh la fiecare concentrație de metacolină sau modificarea rezistenței căilor respiratorii la fiecare doză de pilocarpină a fost comparată la șobolanii VAS și VAD utilizând o analiză unidirecțională a varianței (ANOVA). Abundența proteinelor M2R și M3R în țesutul bronșic sau a retinoizilor din plasmă și a ficatului șobolanilor VAS și VAD a fost comparată folosind studiile lui Studentt-test pentru variabile nepereche. Diferențele au fost considerate semnificative atunci când

Tabelul 1. Retinoizi din plasmă și ficat de la șobolani Lewis

Valorile sunt media ± SE a numărului de șobolani între paranteze. VAD, deficit de vitamina A; TU, vitamina A suficientă.

BHR la animalele neanesteziate.

Evaluarea BHR la animalele neanesteziate ne permite să evaluăm răspunsul la metacolină la șobolani care ar putea fi, de asemenea, utilizat pentru studii privind clearance-ul 99m Tc-DTPA. Penh a fost folosit de alții pentru a evalua obstrucția căilor respiratorii și este un instrument precis și util pentru a evalua modificările seriale ale funcției căilor respiratorii în timpul unui protocol de provocare bronșică la animalele mici (11, 12,35). Datele noastre indică faptul că acest parametru crește după administrarea metacolinei într-un mod dependent de concentrație. Rezultatele studiilor folosind șobolani Sprague-Dawley (Fig.1) și Lewis (Fig.2) sunt prezentate și în ambele cazuri demonstrează că Penh crește într-o măsură mai mare la o concentrație mai mică de metacolină în VAD decât la șobolanii VAS. Diferențele sunt semnificative (ANOVA unidirecțional și testul post hoc Student Newman-Keuls). Rezultatele sunt reprezentative pentru cele trei studii efectuate cu șobolani Sprague-Dawley și trei studii cu șobolani Lewis.