Creșterea secreției și exprimării miostatinei la nivelul mușchilor scheletici de la femeile extrem de obeze

Abstract

OBIECTIV-Obezitatea este asociată cu anomalii endocrine care prezic progresia rezistenței la insulină la diabetul de tip 2. Deoarece s-a demonstrat că mușchiul scheletic secretă proteine ​​care ar putea fi utilizate ca biomarkeri, am caracterizat profilul proteic secretat al celulelor musculare derivate din extrem de obezi (IMC 48,8 ± 14,8 kg/m 2; evaluarea modelului homeostaziei [HOMA] 3,6 ± 1,0). pentru a se înclina subiecți sănătoși (IMC 25,7 ± 3,2 kg/m 2; HOMA 0,8 ± 0,2).

secreției

PROIECTARE ȘI METODE DE CERCETARE—Am emis ipoteza că mușchiul scheletic va secreta proteine ​​care prezic severitatea obezității. Pentru a testa această ipoteză, am folosit un proiect experimental „de jos în sus”, folosind etichetarea stabilă a izotopilor prin aminoacizi în cultură (SILAC) și cromatografie lichidă/spectometrie de masă/spectometrie de masă (LC-MS/MS) pentru a identifica și cuantifica proteinele secretate din miotuburi cultivați derivați de la extrem de obezi în comparație cu femeile sănătoase neobeze.

Caracteristicile clinice ale subiecților donatori pentru cultura celulelor musculare

Marcarea stabilă a izotopilor și colectarea proteinelor secretate.

Identificarea și cuantificarea LC-MS/MS a 13 C6-Lys și a proteinelor secretate nemarcate din miotuburile umane primare slabe și extrem de obeze. A: Proteinele din mediul condiționat de 18 ore, fără ser din miotuburi nemarcate (slabe) și 13 C6-Lys (extrem de obeze) au fost combinate 1: 1 și rezolvate cu 4-16% SDS-PAGE. B: Cromatograful de vârf de bază care arată intensitățile globale ale vârfului și timpul de retenție al tuturor peptidelor extrase dintr-o felie de gel între 37 și 15 kDa. C: O peptidă care eluează la 31,8 minute ca dublet la m/z 706,4 și 709,4, corespunzător peptidei C6-Lys nemarcate și 13 din GAPDH uman. Secvența peptidică prezentată în partea de sus a spectrului a fost obținută prin analiza MS/MS. Peptidele marcate și nemarcate sunt distanțate la 3 Da într-un raport 1: 1 și sunt de acord cu un reziduu de 13 C6-Lys din peptida dublă încărcată. (Vă rugăm să consultați http://dx.doi.org/10.2337/db08-0943 pentru o reprezentare digitală de înaltă calitate a acestei figuri.)

LC-MS/MS, identificarea proteinelor și cuantificarea.

Identificarea LC-MS/MS și cuantificarea proteinei miostatine secretate. A: Spectrul superior prezintă un dublet peptidic la m/z 571,8 și 574,8 corespunzător peptidelor nemarcate și 13 C6-Lys din miostatină umană. Peptidele marcate și nemarcate sunt distanțate la 3 Da într-un raport de 3: 1 și sunt de acord cu un reziduu de 13 C6-Lys din peptida dublă încărcată. Secvența peptidică prezentată în partea de sus a spectrului a fost obținută prin analiza MS/MS a peptidei fragmentate. B: Afișate cu caractere aldine și subliniate sunt pozițiile relative ale celorlalte peptide miostatine identificate în secvența primară a miostatinei umane.

Analiza Western blot a mediului condiționat, a mușchiului scheletic și a plasmei.

Nivelurile de proteină miostatină în mediile condiționate, celulele musculare, întregul mușchi scheletic și plasma au fost verificate folosind imunoblotul occidental. Pentru a colecta proteinele secretate pentru cuantificarea nivelurilor de miostatină, celulele (miotuburile de 9 zile) au fost spălate de cinci ori cu PBS și incubate cu Optimem fără ser (Invitrogen) timp de încă 24 de ore, după cum s-a descris anterior (18,19). Mediul Optimem conține factori de creștere care promovează supraviețuirea celulelor cu incubații extinse și este conceput special pentru caracterizarea proteinelor secretate. Mediul condiționat a fost decantat în tuburi de 50 ml (BD Biosciences Falcon), centrifugat la 300 g și apoi la 1.000 g și filtrat printr-un filtru de nailon de 0,22 μm (Millipore) înainte de o centrifugare finală de 100 000 g pentru a elimina resturile celulare rămase. Mediile condiționate au fost apoi congelate rapid în azot lichid și liofilizate sub vid și apoi precipitate cu acid tricloracetic 10% urmate de mai multe spălări cu acetonă -20 ° C așa cum s-a descris anterior (18). În total, 50 μg de proteine ​​au fost colectate pe probă, separate prin SDS-PAGE și transferate în membrana Immobilon-P PVDF (Millipore).