Cotransportorul Na - Cl sensibil la tiazidă este o proteină PNAS indusă de aldosteron

Editat de Robert W. Berliner, Școala de Medicină a Universității Yale, New Haven, CT și aprobat pe 14 septembrie 1998 (primit pentru revizuire 5 august 1998)

Abstract

Hormonul mineralocorticoid aldosteron reglează excreția urinară de sodiu prin creșterea ratei de absorbție renală a sodiului epitelial (1). Se consideră că situl principal al acțiunii aldosteronului în rinichiul mamiferelor este canalul colector cortical, unde aldosteronul reglează intrarea apicală de sodiu prin canalul de sodiu epitelial sensibil la amiloride (1-3). Cu toate acestea, rezultatele recentelor studii de micropunctură renală (4) și studiile de legare a [3H] metolazonei în membranele corticale renale (4, 5) sugerează că tubul distal contorsionat este un situs suplimentar al tubului renal de acțiune mineralocorticoidă. Intrarea apicală de sodiu în tubul distorsionat este mediată de un cotransportor sensibil la tiazidă Na-Cl (TSC) (6). Astfel, este probabil ca acțiunile presupuse ale aldosteronului să regleze transportul de sodiu în tubul contort distal ar rezulta din reglarea căii de intrare Na-Cl sensibile la tiazidă.

Investigația funcției și reglării TSC a fost facilitată de clonarea recentă a ADNc-urilor pentru cotransportor din vezica urinară (7) și rinichi de șobolan (8), ceea ce a condus la dezvoltarea instrumentelor moleculare pentru localizarea expresiei TSC. Pe baza experimentelor care utilizează hibridizarea in situ (9) și transcripția inversă - PCR (10), s-a ajuns la concluzia că mARN-ul TSC a fost găsit practic exclusiv în tubulul distal contorsionat din rinichiul șobolanului. Studiile imunohistochimice care utilizează anticorpi derivați de proteine de fuziune la TSC au demonstrat, de asemenea, că expresia proteinei TSC în rinichiul de șobolan este limitată la celulele distale ale tubulului convoluit (11).

Ipotezăm aici că aldosteronul poate acționa asupra tubulului distal încurcat pentru a crește expresia TSC a tubului distal încurcat. Pentru a aborda această ipoteză, am dezvoltat un anticorp policlonal derivat din peptide la TSC. Folosind acest anticorp, am efectuat experimente de imunoblotare și imunofluorescență care demonstrează că creșterile nivelurilor circulante de mineralocorticoizi, indiferent dacă sunt obținute prin restricție dietetică de NaCl sau prin administrare de mineralocorticoizi, duc la o creștere semnificativă a expresiei proteinei TSC în tubul distorsionat. Astfel, TSC al tubului renal distal complicat pare a fi o țintă importantă pentru reglarea mediată de aldosteron a excreției renale de clorură de sodiu.

METODE

Anticorpi policlonali.

Pentru imunocitochimie, studiile de față au utilizat, de asemenea, anticorpi monospecifici purificați de afinitate la Na + –K + –2Cl - cotransportor sensibil la bumetantid al membrului ascendent gros și la schimbătorul Na + –Ca 2+, un marker de conectare a tubulilor. Anticorpul Na + –K + –2Cl - cotransportor este un anticorp policlonal de pui (LC20) crescut într-o peptidă sintetică corespunzătoare aminoacizilor 33-55 din cotransportorul de șobolan, pe baza secvenței publicate de Gamba și colab. (7). Acest anticorp a dat o suprapunere completă a marcării cu anticorpul nostru policlonal caracterizat anterior de iepure la cotransportorul Na + –K + –2Cl - (13) în experimentele cu dublă etichetare la șobolan (datele nu sunt prezentate). Anticorpul la schimbătorul Na + –Ca 2+ este mAb de șoarece (Affinity BioReagents, Golden, CO).

Animale și protocoale experimentale.

Șobolani Sprague-Dawley masculi fără patogeni (ferme taconice) cu greutatea de 180-220 g au fost folosiți în acest studiu.

Studiu de restricție NaCl dietetic.

Studiu de perfuzie cu aldosteron.

Șobolanii au fost anesteziați cu metoxifluran (methofan; Pitman - Moore, Mundelein, IL) și minipompele osmotice (model 2ML2; Alzet, Palo Alto, CA) au fost implantate subcutanat pentru a livra 200 μg de aldosteron (Sigma) pe zi. Această rată de livrare pentru aldosteron a fost aleasă pentru a atinge niveluri plasmatice de aldosteron de aproximativ 1000 ng/dl, pe baza observațiilor publicate (16). Aldosteronul a fost inițial dizolvat în dimetil sulfoxid și diluat cu soluție salină izotonică înainte de instalare. Șobolanilor martor li s-au implantat minipumpuri care conțin vehicul singur. Fiecare șobolan a fost hrănit cu o dietă gelificată (preparată așa cum este descris mai sus), oferind o cantitate fixă zilnică de NaCI (58 mg/200 g BW), apă deionizată (25 ml/200 g BW) și chow de bază pentru șobolan (15 g/200 g BW) pe toată durata studiului. Cantitatea de Na din această dietă a fost de 1,0 meq/200 g BW pe zi. După 10 zile de tratament, șobolanii au fost uciși pentru imunoblotare semiquantitativă așa cum este descris mai jos.

Studiu de administrare a fludrocortizonului.

Șobolanii martori și tratați au fost hrăniți o dată pe zi cu o dietă gelificată conținând o cantitate fixă zilnică de apă deionizată (25 ml/200 g BW), NaCl (125 mg/200 g BW), șobolanul de bază (15 g/200 g BW) și 0,5% agar. Pentru șobolanii tratați, fludrocortizonul (Sigma) a fost dizolvat în apă la o concentrație de 50 mg/litru și a fost utilizat la realizarea dietei gelificate. Doza de fludrocortizon a corespuns la 1,2 mg/200 g BW pe zi. După 7 zile de tratament, șobolanii au fost uciși pentru imunoblotare semiquantitativă așa cum este descris mai jos.

Imunoblotarea.

Imunoblotarea semiquantitativă a fost efectuată așa cum este descris (17) pentru a evalua nivelurile relative de expresie ale TSC utilizând omogenate întregi din rinichi întregi ai șobolanilor preparați așa cum este descris mai sus în Animale și Protocoale experimentale. Pe scurt, rinichii întregi au fost omogenizați utilizând un omogenizator de țesuturi (Omni 1000 echipat cu un generator de dinți de ferăstrău) în soluție de izolare rece ca gheața (pH 7,6) conținând 250 mM zaharoză, 10 mM trietanolamină (Calbiochem), 1 μg/ml leupeptină ( Bachem) și 0,1 mg/ml fluorură de fenilmetilsulfonil (Statele Unite Biochimice) și concentrația totală de proteine (kit de acid bicinchoninic (BCA); Pierce) a fost ajustată la 1,2 μg/μl cu soluție de izolare. Probele au fost solubilizate în 5 × tampon de probă Laemmli (1 vol per 4 vol de probă) urmat de încălzire la 60 ° C timp de 15 minute. Gelurile inițiale SDS/poliacrilamidă colorate în albastru Coomassie au confirmat că probele au fost potrivite în ceea ce privește conținutul de proteine.

Pentru imunoblotare, SDS/PAGE a fost efectuată utilizând minigeluri de poliacrilamidă 7,5%, iar proteinele au fost transferate electroforetic pe membranele nitrocelulozice așa cum este descris (13). După blocarea cu 5 g/dl lapte uscat fără grăsime, membranele au fost sondate cu anticorp policlonal purificat de afinitate la TSC (L573) la o concentrație IgG de 0,2 μg/ml într-o soluție tampon de diluare a anticorpului conținând 150 mM NaCI, 50 mM fosfat de sodiu, 10 mg/dl azidă de sodiu, 50 mg/dl Tween 20 și 1 g/dl BSA (pH 7,5). Anticorpul secundar a fost IgG anti-iepure de măgar conjugat cu peroxidază de hrean (Pierce; nr. Catalog 31458) utilizat la o concentrație de 0,16 μg/ml. Locurile de reacție anticorp - antigen au fost vizualizate utilizând chemiluminescență îmbunătățită pe bază de luminol (LumiGLO; Kirkegaard și Perry Laboratories) înainte de expunerea la film cu raze X (Kodak nr. 165-1579 film imagistic științific). Controalele au fost efectuate așa cum este descris în Rezultate, folosind antiserul purificat prin afinitate preadorbit cu peptida imunizantă.

Caracterizarea anticorpului anti-TSC prin imunoblotare. (A) Imunoblot al fracției de membrană brută (17.000 × g pelete de la supernatant de 4.000 × g centrifugare) de cortex renal de șobolan (10 μg de proteină totală pe bandă) sondat cu anti-TSC purificate prin afinitate [concentrație Ig G, 0.2 μg/ml, banda stângă] sau același anticorp preadorbit cu 1 mg de peptidă imunizantă (banda dreaptă). (B) Imunoblot care prezintă localizarea regională a TSC în rinichi de șobolan. Fiecare bandă a fost încărcată cu o fracție de membrană brută obținută din cortex, medulă exterioară (OM) și medulă internă (IM), respectiv (10 μg de proteină totală pe bandă). (C) Imunoblot care prezintă rezultatele centrifugării diferențiale a omogenatului cortical de la șobolan efectuată așa cum este descris (12). Prima bandă, pelete de la centrifugare la 17.000 × g timp de 20 de minute după centrifugarea inițială la 1.000 × g timp de 10 minute la 4 ° C. A doua bandă, pelete de la centrifugare la 200.000 × g timp de 1 oră. A treia bandă, supernatant de la 200.000 × g centrifugare. Fiecare bandă a fost încărcată cu 10 μg de proteine totale. Banda predominantă de 165 kDa este prezentată în fracțiunile de membrană (pelete de la 17.000 × g și 200.000 × g centrifugare), în timp ce este absentă din fracția citosolică (supernatant final).