Conținutul de acid alfa linolenic al semințelor de in este asociat cu o inducție a leptinei adipoase
Abstract
Introducere
Adipocitele, celulele care alcătuiesc cea mai mare parte a țesutului adipos din organism, au un rol fiziologic important dincolo de capacitatea lor de stocare a lipidelor. Ele secretă o serie de molecule de semnalizare celulare importante, denumite adipokine. Aceste adipokine au consecințe variind de la efecte autocrine și paracrine locale la acțiuni endocrine sistemice. Adipokinele variază foarte mult atât în funcția lor, cât și în mecanismele de control. Un astfel de mecanism de control este compoziția de acizi grași a țesutului adipos care poate afecta semnalizarea celulară, traficul de acizi grași, expresia genelor și, în consecință, metabolismul [1]. Compoziția țesutului adipos variază în funcție de doi factori principali: echilibrul energetic, care reglează metabolismul acizilor grași liberi din țesutul adipos și dieta, care va modifica profilul acizilor grași al țesutului adipos. Deși primul a fost examinat pe larg, în special în ceea ce privește expresia leptinei și diferențierea adipocitelor, efectele acestuia din urmă asupra funcției endocrine au fugit recent pentru a fi investigate.
Adiponectina este cea mai puternic exprimată și secretată adipokină, cu efecte benefice asupra metabolismului, inflamației și funcției vasculare. Adiponectina are un model de expresie paradoxal. Pe măsură ce adipozitatea crește, exprimarea și secreția adiponectinei scade în țesutul adipos [2]. Se crede că acest paradox face parte din patologia obezității și este simptomatic al țesutului adipos disfuncțional. Adiponectina joacă un rol în sensibilitatea la insulină, oxidarea LDL, activarea eNOS, suprimarea inflamației și catabolismul acizilor grași [3-5). Astfel, hipoadiponectinemia prezintă interes ca biomarker atât al bolilor cardiovasculare, cât și al sindromului metabolic.
O altă adipokină importantă care ar putea fi stimulată de modificări ale profilului acizilor grași este leptina. A fost descoperită mai întâi ca proteină codificată de atârna genă, denumită după fenotipul șoarecelui knockout dublu. Acești șoareci nu experimentează nici o sațietate și, astfel, mănâncă continuu când sunt hrăniți ad libitum, ducând la obezitate severă indusă de dietă. La om, deficitul de leptină a fost implicat în cazurile de obezitate morbidă, fie ca factor genetic, fie ca insuficiență metabolică [6, 7]. Rolul leptinei în suprimarea apetitului mediată hipotalamic ca răspuns la aportul caloric nu este singura sa funcție. Leptina poate fi, de asemenea, importantă în modularea activității celulelor T în stadiile incipiente ale dezvoltării aterosclerotice, precum și în alte celule imune [8]. În obezitate, leptina poate fi sub-exprimată de țesutul adipos ca răspuns la o dietă calorică constantă sau receptorii de leptină pot fi reglați în jos, ducând astfel la niveluri ridicate de leptină plasmatică și rezistență la leptină [9].
Semințele de in au câștigat recent popularitate ca aliment funcțional. Acidul alfa-linolenic (ALA) cuprinde aproximativ 55% din conținutul total de acizi grași din acizii grași din semințe de in [10]. Dietele bogate în ALA, inclusiv dietele îmbogățite cu semințe de in măcinate, au fost demonstrate în studii intervenționale și experimentale pentru a reduce atât infarctul miocardic fatal, cât și non-fatal [11, 12], aritmiile cardiace [12-15] și incidența leziunilor aterosclerotice. [12, 14, 16, 17]. Cu toate acestea, mecanismul prin care ALA și semințele de in induc această acțiune cardio-protectoare este neclar. Datele anterioare au indicat faptul că ALA dintr-o dietă îmbogățită cu semințe de in se depune în țesutul adipos [18]. Prin urmare, este posibil ca această modificare a conținutului de acid gras al țesutului adipos să afecteze funcția țesutului adipos. Ipotezăm că schimbarea compoziției lipidice în țesutul adipos ca răspuns la o dietă suplimentată cu semințe de in poate afecta semnalizarea adipokinei de la adipocite. Prin urmare, este posibil ca acțiunile cardiovasculare benefice ale semințelor de in observate anterior să poată fi asociate cu modificări ale expresiei adipokinei.
Materiale și metode
Dieta și hrănirea
Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Consiliului canadian pentru îngrijirea animalelor. Șaisprezece bărbați iepuri albi din Noua Zeelandă (2,8 ± 0,1 kg, iepure trandafir de sud) au fost repartizați aleatoriu pentru a primi una din cele patru diete. Dietele au fost preparate așa cum s-a descris anterior [15, 17] prin adăugarea de componente la o dietă obișnuită (RG) de iepure (CO-OP Complete Rabbit Ration, Federated Co-operatives): 0,5% colesterol (CH) sau 10% semințe de in macinate (FX), sau ambele (CF) timp de 8 săptămâni = 4). Chow a fost depozitat la 4 ° C și protejat de lumină. Dietele s-au diferit numai în ceea ce privește conținutul total de grăsimi datorită includerii semințelor de in macinate bogate în ALA natural (tabelele 1, 2). Compoziția de acizi grași din dietă este prezentată în tabelul 2. Adăugarea semințelor de in la dietă a crescut semnificativ cantitatea de C16: 0, C18: 0, C18: 1 (acid oleic) și C18: 3 (ALA) furnizate. Adăugarea de colesterol nu a avut niciun efect semnificativ asupra acizilor grași alimentari furnizați în comparație cu dieta RG. Iepurii au fost hrăniți cu 125 g/zi de dietă.
Eșantionare și analiză de sânge
Sângele a fost extras din vena urechii marginale stângi a iepurilor, care au fost postiti peste noapte înainte de a începe dieta experimentală și la 8 săptămâni. A fost colectat în tuburi vacutainer conținând EDTA (Becton-Dickinson). Probele de sânge au fost centrifugate la 4.500 ×g la temperatura camerei timp de 10 minute, iar plasma a fost apoi stocată la -80 ° C. Înainte de analiză, probele de plasmă au fost decongelate și centrifugate la 6.800 ×g. Nivelurile plasmatice ale colesterolului și trigliceridelor au fost analizate folosind un analizor VetTest 8008 de chimie a sângelui (Laboratoarele IDEXX). Acizii grași au fost extrasați din plasmă și derivați, așa cum s-a descris anterior [15, 18].
Colecția de țesuturi
După 8 săptămâni de tratament dietetic, animalele au fost eutanasiate cu 5% gaz izofluran livrat prin mască facială, urmate de extracție cardiacă. Au fost colectate țesut adipos retroperitoneal și epididimal. Pentru a preveni contaminarea cu RNase, animalul și instrumentele au fost pulverizate cu RNaseZap (Ambion) atât înainte, cât și în timpul colectării țesuturilor. Țesutul adipos a fost plasat imediat în ARNlater și păstrat peste noapte la 4 ° C, așa cum se indică în instrucțiunile producătorului (Ambion). Testele preliminare au indicat faptul că a existat o stabilizare cu succes a ARNm comparativ cu congelarea rapidă sau întreținerea peste noapte la 4 ° C (așa cum a fost evaluat prin electroforeză pe gel de agaroză și ulterior qRT-PCR) în ciuda conținutului ridicat de lipide din acest țesut. ARNlater a fost îndepărtat din țesut prin aspirație, iar probele au fost apoi congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80 ° C.
qRT-PCR
ARN-ul a fost extras din țesutul adipos într-un mediu fără RNază. Țesutul adipos a fost omogenizat în reactiv Trizol (Invitrogen), iar grăsimea a fost îndepărtată. Fenolul a fost separat de soluție prin spălarea soluției de două ori cu cloroform. ARN a fost precipitat din soluție cu etanol și adăugat la coloanele RNeasy pentru purificare ulterioară (Qiagen). ARN-ul extras a fost cuantificat și evaluat pentru calitate prin spectrofotometru și electroforeză pe gel de agaroză. A fost apoi folosit pentru qRT-PCR (Quanta Biosystems) folosind un sistem de detecție PCR în timp real iQ5 (Bio-Rad). Grundele concepute utilizând software-ul BLAST (NCBI) și au fost după cum urmează: Adiponectină: (Forward 5′ACCAGGACAAGAACGTGGAC3 ′, Reverse 5′TGGAGATGGAATCGTTGACA3 ′);
Leptină: (Forward 5′GTCGTCGGTTTGGACTTCATC3 ′, Reverse 5′CGGAGGTTCTCCAGGTCGTTG3 ′) [19];
GAPDH: (Înainte 5′GATGGTGAAGGTCGGAGTGAA3 ′, Reverse 5′GGTGAAGACGCCAGTGGATT3 ′).
Grundele au fost validate utilizând software-ul BLAST al NCBI [21]. Probele neutilizate au fost depozitate la -80 ° C. ADNc a fost sintetizat din 1 ug de ARN cu qScript cDNA Supermix (Quanta) prin instrucțiunile producătorului. qPCR a continuat timp de 2 minute la 50 ° C, 95 ° C timp de 8,5 min, apoi 40 de cicluri de 95 ° C timp de 15 s și 60 ° C timp de 60 s, moment în care datele au fost capturate. O curbă de topire a fost obținută după ciclare cu 95 ° C timp de 1 min, urmată de 55 ° C timp de 1 min și 80 de cicluri de captare de 10 s de 55 + 0,5 ° C/ciclu. Rezultatele au fost normalizate prin expresia GAPDH și analizate prin metoda delta - delta-Ct utilizând software-ul de detectare în timp real iCycler.