Clonarea frontierelor și caracterizarea colesterolului 25-hidroxilază (ch25h) dintr-un teleost marin

Pescuit marin, acvacultură și resurse vii

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Nutriția, metabolismul și fiziologia peștilor Vizualizați toate cele 14 articole

Editat de
Kang-le Lu

Colegiul de pescuit, Universitatea Jimei, China

Revizuite de
Min Jin

Universitatea Ningbo, China

Dizhi Xie

South China Agricultural University, China

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

clonarea

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Institutul de cercetare în domeniul pescuitului în Marea Galbenă, Academia Chineză de Științe a Pescuitului, Qingdao, China
  • 2 Laborator pentru știința pescuitului marin și procesele de producție a alimentelor, Laboratorul național Qingdao pentru știința și tehnologia marină, Qingdao, China

Introducere

Enzima colesterol 25-hidroxilază (Ch25h) asociată membranei catalizează formarea 25-hidroxicolesterolului (25HC, oxisterol) din colesterol și, prin urmare, joacă un rol important în metabolismul colesterolului și al lipidelor (Lund și colab., 1998; Horton și colab., 2002; Joseph și colab., 2002). S-a raportat că 25HC este un co-represor care blochează procesarea proteinelor care leagă elementul de reglare a sterolului (SREBP) și duce în cele din urmă la inhibarea transcripției genelor (Lund și colab., 1998). 25HC acționează, de asemenea, ca un ligand al receptorului ficatului X (LXR). Reglarea căii de semnalizare LXR/SREBP cu 25HC reduce sinteza colesterolului și crește efluxul și eliminarea acestuia (Janowski și colab., 1996; Accad și Farese, 1998; Radhakrishnan și colab., 2007). Reglarea căii de semnalizare LXR/SREBP cu 25HC afectează, de asemenea, metabolismul lipidic în alte moduri, în funcție de rolurile SREBP și LXR în metabolismul lipidelor (Shimano, 2001; Oosterveer și colab., 2010; DeBose-Boyd și Ye, 2018). În plus față de rolul metabolic bine cunoscut al oxisterolilor, unele publicații au raportat și funcția 25HC în reglarea imunității și rezistența la viruși (Yi și colab., 2012; Shrivastava-Ranjan și colab., 2016; Cagno și colab., 2017; Doms și colab., 2018; Shawli și colab., 2019; Zhang și colab., 2019).

În comparație cu mamiferele, funcțiile Ch25h sau 25HC la pești au fost slab înțelese. Doar la peștele zebră, rolul antiviral independent de interferon al 25HC a fost validat (Pereiro și colab., 2017). În limbajul limbii chineze, un studiu recent al nostru cu proces de hrănire urmat de analize transcriptomice a arătat acest lucru ch25h transcrierea în creier a fost afectată semnificativ de acidul arahidonic dietetic (ARA), care joacă un rol important în reproducerea peștilor (Izquierdo și colab., 2001; Norberg și colab., 2017), iar acest efect a fost diferit între peștii masculi și femele (Xu și colab., 2019). Studiile noastre anterioare au arătat, de asemenea, că ARA dietetică reglează diferențial steroidogeneza gonadică în talpa limbii chinezești, în funcție de sexul peștilor (Xu și colab., 2017a). Talpa limbii chinezești are caracteristici tipice ale dimorfismului sexual. Răspunsul diferit al metabolismului colesterolului la ARA dietetică la talpa limbii chinezești masculine și feminine pare interesant și merită investigații suplimentare. Ca studiu de urmărire, studiul de față a urmărit clonarea și caracterizarea mARN-ului de lungime completă al tălpii limbii chinezești ch25h, precum și pentru a investiga transcrierea acestuia ca răspuns la ARA dietetică în diferite țesuturi ale peștilor masculi și feminini. Rezultatele vor contribui la cunoașterea generală a fiziologiei Ch25h la pești.

Materiale și metode

Încercare de hrănire

Trei diete experimentale care conțin diferite niveluri de ARA au fost utilizate în studiul de hrănire (Tabelul 1). În dieta de control (dieta C), tristearina a fost utilizată ca sursă principală de lipide suplimentate. Dietele cu niveluri scăzute (Diet ARA-L) și ridicate (Diet ARA-H) au fost preparate prin înlocuirea tristearinei din dieta C cu ulei îmbogățit cu ARA. Conținutul ARA în cele trei diete experimentale a fost de 0,34, 2,53 și, respectiv, 9,63% din totalul acizilor grași (TFA), respectiv (Tabelul 2). Nivelurile constante de ulei îmbogățit cu LC-PUFA și lecitină de soia au fost suplimentate tuturor dietelor pentru a îndeplini cerința. Dietele experimentale au fost pregătite urmând procedurile de rutină din laboratorul nostru (Xu și colab., 2016).

tabelul 1. Formularea și compoziția dietelor experimentale (g kg –1 substanță uscată) a .

masa 2. Compoziția acizilor grași din dietele experimentale (% acizi grași totali).

A fost efectuat un studiu de hrănire de 10 săptămâni pentru a investiga efectele ARA dietetice asupra ch25h expresii genetice în limbă chineză. Talpa limbii chinezești eclozată în toamna trecută a fost utilizată în procesul de hrănire. Peștii au fost hrăniți cu o dietă comercială înainte de experiment. Cincisprezece pești masculi cu o greutate corporală inițială medie de 20,3 g și opt pești femele cu o greutate medie inițială de 72,0 g au fost crescuți în fiecare rezervor de polietilenă (200 L). La începutul studiului de hrănire, peștii au fost hrăniți cu dieta de control timp de 7 zile pentru a se acomoda cu condițiile experimentale. Testul de hrănire a fost efectuat într-un sistem de curgere a apei de mare în Huanghai Aquaculture Co., Ltd., (Haiyang, China). Fiecare dietă a fost repartizată aleatoriu în tancuri triplate. Peștii au fost hrăniți manual până la satisfacție aparentă de două ori pe zi (9:00 și 17:00). Rezervoarele au fost curățate zilnic prin sifonarea furajelor reziduale și a fecalelor.

La sfârșitul studiului de hrănire (toamna târziu), după ce a fost anesteziat cu eugenol (1: 10.000), starea de dezvoltare a gonadelor de pește a fost determinată înainte de prelevare. Majoritatea peștilor masculi erau maturi. Maturitatea peștilor masculi a fost confirmată de eliberarea laptelui la manipulare. Cu toate acestea, din păcate, observarea vizuală și examinarea microscopică a morfologiei ovocitelor au arătat că majoritatea peștilor de sex feminin erau imaturi, iar ovarele nu se dezvoltaseră deloc. Au fost disecați cinci pești masculi maturi și cinci pești femele imature pe tanc și s-au recoltat probe întregi de creier, gonadă și ficat. Toate probele de țesut au fost imediat înghețate cu azot lichid și depozitate la -86 ° C înainte de analiză. Toate protocoalele de prelevare a probelor, precum și practicile de creștere a peștilor, au fost revizuite și aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Institutului de cercetare în domeniul pescuitului în Marea Galbenă.

Extracția ARN și sinteza ADNc

ARN-ul total din ficat a fost extras folosind RNAiso Plus [TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd., Dalian, China] și apoi electroforizat pe 1,5% gel de agaroză pentru a testa calitatea și integritatea. Concentrația a fost determinată cu spectrometrul Colibri Microvolume (Titertek-Berthold, Germania). ARN-ul a fost apoi transcris invers cu kitul de reactivi PrimeScript TM RT cu gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa) conform manualului de utilizare.