Canalul Mergla K induce atrofia mușchilor scheletici prin activarea căii proteazomului ubiquitinei -

Departamentul de Științe Medicale de Bază, Școala de Medicină Veterinară, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Departamentul de Chimie Medicinală și Farmacologie Moleculară, Colegiul de Farmacie, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Departamentul de Științe Clinice Veterinare, Școala de Medicină Veterinară, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Departamentul de Științe Medicale de Bază, Școala de Medicină Veterinară, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Departamentul de Patobiologie Veterinară, Centrul pentru Cancer, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Departamentul de Științe ale Animalelor, Colegiul de Agricultură, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Institutul cardiovascular, Universitatea din Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvania, SUA

Departamentul de Științe Medicale de Bază, Școala de Medicină Veterinară, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare. Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Științe Medicale de Bază, Școala de Medicină Veterinară, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare. Corespondență: Școala de Medicină Veterinară, Universitatea Purdue, 625 Harrison St., West Lafayette, IN 47907, SUA. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Științe Medicale de Bază, Școala de Medicină Veterinară, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Departamentul de Chimie Medicinală și Farmacologie Moleculară, Colegiul de Farmacie, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Departamentul de Științe Clinice Veterinare, Școala de Medicină Veterinară, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Departamentul de Științe Medicale de Bază, Școala de Medicină Veterinară, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Departamentul de patobiologie veterinară, Centrul pentru cancer, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Departamentul de Științe ale Animalelor, Colegiul de Agricultură, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Institutul cardiovascular, Universitatea din Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvania, SUA

Departamentul de Științe Medicale de Bază, Școala de Medicină Veterinară, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare. Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Științe Medicale de Bază, Școala de Medicină Veterinară, Universitatea Purdue, West Lafayette, Indiana, SUA

ABSTRACT

Atrofia mușchilor keletali, o reducere a conținutului de proteine contractile și a forței musculare, poate rezulta din deteriorarea mușchilor, boli, neutilizare sau îmbătrânire (1-4); debilitarea rezultată poate compromite serios calitatea vieții. Terapia fizică și administrarea factorilor de creștere (5), inhibitori ai proteolizei (6) sau stimulatori ai sintezei proteinelor (7) sunt metode studiate pentru tratarea atrofiei; cu toate acestea, sunt necesare tratamente mai eficiente. Calea proteazomului ubiquitin (UPP), prin care substraturile proteice sunt degradate (8), este proeminentă printre mecanismele cunoscute pentru a modula atrofia mușchilor scheletici; cu toate acestea, se știe puțin despre factorii care activează această cale.

MATERIALE ȘI METODE

Animale Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor Purdue. ND4 - Șoarecii elvețieni Webster (Harlan - Sprague, Indianapolis, IN) au fost utilizați în toate procedurile, cu excepția studiilor tumorale care au folosit șoareci atimici (NCr - nu; Harlan - Sprague). Animalele au fost adăpostite în facilitățile Universității Purdue, monitorizate de medicii veterinari de laborator și au furnizat hrană și apă ad libitum.

Suspensia membrelor posterioare

Cuștile suspendate personalizate au fost construite așa cum s-a descris anterior (16). Șoarecii au fost așezați în aceste cuști, odihnindu-se într-o înclinare de aproximativ 30 ° cu capul în jos, cu membrele posterioare ridicate, astfel încât nu au putut să pună nicio sarcină pe membrele posterioare. Șoarecii martori au fost ținuți în cuști de șoarece comerciale într-o stare normală cu greutate.

Inducerea tumorii

Kb celule canceroase esofagiene umane (7000 celule/100 pl de mediu RPMI cu 10% FBS și 1% glutamină; 17) au fost implantate subcutanat (s.c.) în axila dreaptă a șoarecilor atimici= 8; NCr - nu; Harlan-Sprague). Șoareci de control (= 8) au fost injectate cu vehicul. Șoarecii au fost cântăriți săptămânal timp de 6 săptămâni. Tumorile au fost măsurate cu un etrier digital o dată la două săptămâni.

Western blot

Pentru imunobloti, proteinele de membrană au fost extrase din mușchii gastrocnemius și creier (14). Probele au fost imunoblotate folosind anticorp erg1 (Ab) (14). După ștergere, membranele au fost colorate cu 0,1% Coomassie R-250 pentru a confirma că probele de membrană conțin proteine egale.

Secțiuni de țesut și colorare

Mușchii gastrocnemius au fost pregătiți și crio-secționați (14 µm) așa cum s-a descris anterior (16). Secțiunile au fost colorate pentru activitatea β-galactozidazei (lacZ) (16) sau imunocolorate (16) folosind erg1 Ab (14), cu excepția cazului în care se menționează. Imaginile secțiunilor au fost capturate cu o cameră digitală Leaf Micro - Lumina (Scitex; Tel - Aviv, Israel). Numărul de pixeli al fiecărei secțiuni transversale a fibrelor musculare a fost determinat (Adobe Photoshop 6) și transformat în µm 2. Au fost analizate două secțiuni (câte 50 de fibre) din fiecare secțiune a mușchiului.

Plasmide

Clonele Mergla (10), Merg1b (10) și DN - Mergla (G628S; 15) au fost în pBK/citomeglovirus (CMV). Luciferaza cu licurici ubiquinată (Ub - FL) din pGL - 3/CMV a fost un cadou de la Dr. David Piwnica - Worms (18; Washington University, St. Louis, MO). Vectorul CMV - nlacZ în pNL a fost achiziționat de la Centrul Comercial de Gros (Toulouse, Franța). PhRL sintetic Renilla vectorul reporter luciferază (RL) a fost achiziționat de la ProMega (Madison, WI).

Electroporare

Șoarecii au fost anesteziați cu 0,01 μl/mg în greutate corporală de xilazină (1 mg/ml) și ketamină (9 mg/ml) în ser fiziologic steril. Mușchii Gastrocnemius ai membrelor posterioare bărbierite au fost injectați cu plasmide și electroporați cu 8 impulsuri la 200V/cm timp de 20 ms la 1 Hz (19) cu o matrice extracelulară (ECM) 830 ElectroSquare Porator (BTX; Hawthorne, NY).