Varianta hipoalergenică a alergenului principal de albuș de ou Gal d 1 produsă prin întreruperea cisteinei

Pathum Dhanapala

1 Laborator de Cercetare Neuro-Alergică (NARL), Școala de Științe ale Vieții și Mediului, Facultatea de Științe, Inginerie și Mediu Construit, Universitatea Deakin, 75 Pigdons Road, Geelong 3216 VIC, Australia; ua.ude.nikaed@muhtapd sau ude.dravrah.hwb@alapanahdp (P.D.); ua.ude.nikaed@ahtiwa (D.W.-D.)

2 Laborator australian de sănătate animală (AAHL), Biosecurity Flagship, Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO), 5 Portarlington Road, East Geelong 3219 VIC, Australia; [email protected]

3 Păsări CRC, P.O. Box U242, Universitatea din New England, Armidale 2351 NSW, Australia

4 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 60 Fenwood Road, Boston, 02115 MA, SUA

Dulashi Withanage-Dona

Mimi L. K. Tang

5 Departamentul de Alergie și Imunologie, Royal Children's Hospital, 50 Flemington Road, Parkville 3052 VIC, Australia; [email protected]

6 Alergii și tulburări imune, Institutul de cercetare pentru copii Murdoch, 50 Flemington Road, Parkville 3052 VIC, Australia

7 Universitatea din Melbourne, Parkville 3010 VIC, Australia

Tim Doran

3 Păsări CRC, P.O. Box U242, Universitatea din New England, Armidale 2351 NSW, Australia

Cenk Suphioglu

3 Păsări CRC, P.O. Box U242, Universitatea din New England, Armidale 2351 NSW, Australia

Abstract

1. Introducere

Producția de Gal d 1 hipoalergenică poate fi realizată prin utilizarea mutagenezei ca instrument în două strategii diferite: prima este prin mutarea secvențelor epitopilor de legare IgE și a doua este prin țintirea structurii secundare a proteinelor. Drew și colab. (2004) [19] au produs cu succes o variantă hipoalergenică a alergenului principal la latex Hev b 6.10 prin întreruperea legăturilor cisteină-cisteină a proteinei pentru a reduce reactivitatea IgE. În acest studiu, am produs cu succes o variantă hipoalergenică a Gal d 1, vizând doar două dintre cele nouă punți cisteină-cisteină folosind mutageneză direcționată la fața locului.

2. Metode

2.1. Mutageneza dirijată de site a lui Gal d 1

Secvența de nucleotide și aminoacizi a lui Gal d 1. Reziduurile pătrate de cisteină (C) la pozițiile C192 și C210 sunt reziduurile vizate. Acestea au fost înlocuite cu alanină prin mutarea nucleotidelor la GCC.

Structura secundară a lui Gal d 1 care arată numărul total de punți de cisteină. Cele două săgeți arată cele două punți de cisteină care ar fi distruse de mutațiile prezentate în Figura 1. Figura adaptată din: Kato și colab., 1987 [1].

tabelul 1

Componentele amestecului principal al reacției în lanț polimerază mutagenă (PCR).

Componenta de reacție Volumul utilizat (µL)

10 × QuickChange Lightning Multi tampon de reacție	2.5
Apă dublu distilată	15.5
Șablon ADN	1 (50 ng)
Primeri mutageni	1 din fiecare grund (100 ng din fiecare grund)
Amestec de trifosfat deoxi-nucleozidic (dNTP)	1
QuickChange Lightning Multi amestec enzimatic	1
Total	25

masa 2

Condiții PCR mutagene.

SegmentCyclesTemperatureTime

1	1	95 ° C	2 min
2	30	95 ° C	20 s
		55 ° C	30 s
		65 ° C	3 min (30 s/kb lungime plasmidă)
3	1	65 ° C	5

2.2. Transformarea chimică în E. coli

2.3. Expresia în timp a cursului Gal d 1 mutant pentru a determina timpul optim de expresie

O singură colonie de mutant Gal d1 a fost crescută peste noapte în mediu LB cu 50 pg/ml ampicilină. Cultura peste noapte a fost apoi subcultivată în 10 ml de mediu LB proaspăt și crescută până la faza mediană a logului (OD600 0,4-0,6). O probă de 1 ml de celule a fost peletizată pentru a fi utilizată ca control neexprimat (0 h) al expresiei în timp. Expresia a fost apoi indusă cu 40 uL de IPTG și celulele au fost incubate timp de 6 ore la 37 ° C cu agitare la 250 rpm. O probă de 1 ml a fost colectată la fiecare o oră pentru perioada de 6 ore. Peletele colectate la punctele de timp 0, 2, 4, 5 și 6 au fost lizate folosind 400 de l de reactiv de liza Cell Lytic B (Sigma Aldrich, Natick, MA, SUA) și centrifugate la 13.000 × g timp de 5 minute pentru a separa peleta ( fracția insolubilă) și supernatantul (fracția solubilă). Cele două fracții au fost analizate folosind SDS-PAGE și western blot conform metodelor descrise în Dhanapala și colab. 2015 [20].