Urmărirea pe termen lung a neuropatiei enterice indusă de buserelină la șobolani
ANETTE JÖNSSON
1 Departamentul de Științe Clinice, Divizia de Medicină Internă, Spitalul Universitar Skåne, Universitatea Lund, 205 02 Malmö, Suedia
ELIN SAND
1 Departamentul de Științe Clinice, Divizia de Medicină Internă, Spitalul Universitar Skåne, Universitatea Lund, 205 02 Malmö, Suedia
2 Departamentul de Științe Medicale Experimentale, Unitatea de Neurogastroenterologie, BMC B11, Universitatea Lund, 221 84 Lund, Suedia
EVA EKBLAD
2 Departamentul de Științe Medicale Experimentale, Unitatea de Neurogastroenterologie, BMC B11, Universitatea Lund, 221 84 Lund, Suedia
BODIL OHLSSON
1 Departamentul de Științe Clinice, Divizia de Medicină Internă, Spitalul Universitar Skåne, Universitatea Lund, 205 02 Malmö, Suedia
Abstract
S-a demonstrat că câțiva pacienți dezvoltă dureri abdominale severe și dismotilitate gastro-intestinală în timpul tratamentului cu analogi ai hormonului de eliberare a gonadotropinei (GnRH). Un model de neuropatie enterică la șobolani a fost dezvoltat prin administrarea de buserelină analogică GnRH la șobolani. A fost descrisă pierderea neuronilor enterici și a ganglioneuritei pe tot tractul gastro-intestinal, fără alte modificări histopatologice. Scopul prezentului studiu a fost investigarea efectelor pe termen lung ale acestui model de șobolan asupra greutății corporale și asupra morfologiei și modificărilor inflamatorii ale tractului gastro-intestinal. Șobolanilor li s-au administrat injecții subcutanate de buserelină sau soluție salină o dată pe zi timp de 5 zile și li s-a permis să se recupereze timp de 3 săptămâni. Acest regim a fost repetat de patru ori. Șobolanii au fost cântăriți săptămânal și au fost sacrificați la 16 săptămâni după al patrulea tratament. Peretele intestinal a fost măsurat prin morfometrie și a fost evaluată prezența neuronilor enterici, mastocitelor, eozinofilelor și limfocitelor T. Șobolanii tratați cu Buserelin s-au dovedit a avea o greutate corporală mai mică la sacrificiu, în comparație cu martorii (P Cuvinte cheie: neuropatie enterică, hormon eliberator de gonadotropină, tract gastrointestinal, model de șobolan
Introducere
Hormonul care eliberează gonadotropina (GnRH) stimulează secreția hormonului foliculostimulant (FSH) și a hormonului luteinizant (LH) din glanda pituitară, care reglează secreția de hormoni steroizi, cum ar fi estrogenul și progesteronul (1). Receptorii GnRH și LH au fost identificați în tractul gastrointestinal uman și de șobolan (GI) (2-4), unde GnRH inhibă proliferarea celulară (5,6). Stimularea LH fragmentează complexul mioelectric care migrează în intestinul subțire (7) și reduce supraviețuirea neuronilor enterici de șobolan în cultură (8). Un număr de pacienți suferă de efecte secundare GI în timpul tratamentului cu analogi GnRH, iar câțiva pacienți dezvoltă pseudo-obstrucție intestinală cronică (CIPO) sau dismotilitate enterică (DE) cu modificări degenerative și inflamatorii în tractul gastrointestinal (3,9).
Studiile anterioare la șobolani au arătat că analogii GnRH provoacă pierderea neuronilor submucoși și myenterici în fund, ileon și colon, fără niciun efect asupra greutății corporale, biomarkeri circulanți inflamatori sau morfometrie a peretelui intestinal (4,10). Numărul de mastocite și eozinofile s-a dovedit a fi nealterat; cu toate acestea, au fost identificate semne de ganglioneurită cu infiltrare a limfocitelor T în ganglionii enterici (4,11). Au fost observate niveluri ridicate de estradiol în plasmă și un strat muscular uterin îngroșat, împreună cu un număr relativ redus de neuroni imunoreactivi la receptorii LH și imunoreactivitate crescută a caspazei-3 activate (4,10). Astfel, tratamentul cu buserelină la șobolani constituie un model de neuropatie enterică la șobolani și se anticipează că pierderea neuronală va fi mediată prin eliberare crescută de LH și hiperactivare a neuronilor enterici purtători de receptor LH (4,10,11), rezultând apoptoza crescută (4)., 12).
Rezultatele anterioare se bazează pe studii în care animalele au fost sacrificate la scurt timp după tratamentul final cu buserelină (4,10,11). Scopul prezentului studiu a fost de a investiga efectul pe termen lung al neuropatiei enterice induse de buserelină asupra greutății corporale și asupra tractului gastrointestinal în ceea ce privește pierderea celulelor neuronale, morfologia și modificările inflamatorii.
Materiale și metode
Animale
Au fost folosiți șobolani Sprague-Dawley femele (n = 20; vârstă, 7 săptămâni; greutate, 170-180 g), achiziționate de la Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germania). Șobolanii au fost lăsați să se aclimatizeze la instalația pentru animale controlate de lumină și climă timp de cel puțin 5 zile înainte de experimentare. Chow de șobolan standard (4% grăsime/g) (Lactamin R36, Stockholm, Suedia) și apă au fost furnizate ad libitum. Proiectul experimental a fost aprobat de Comitetul de etică a animalelor, Lund și Malmö, Suedia (M350-12, data aprobării: 14.11.12). Animalele au fost utilizate în conformitate cu Directiva Consiliului Comunităților Europene (2010/63/UE) și Legea suedeză privind bunăstarea animalelor (SFS 1988: 534).
Design de studiu
Șobolanilor (n = 12) li s-a administrat 20 μg de buserelină analogică GnRH (1 mg/ml) (Suprefact, Sanofi-Aventis, Bromma, Suedia) (dizolvat în 0,2 ml soluție salină) subcutanat, o dată pe zi timp de 5 zile, urmat de 3 săptămâni de recuperare, reprezentând o sesiune de tratament (4). Doza și administrarea de buserelină se bazează pe studii anterioare care au demonstrat efecte fiziologice fiabile în ceea ce privește hipertrofia uterină, fără efecte adverse (4,10,13). Animalele martor (n = 8) au primit 0,2 ml injecții saline. Animalele au fost cântărite înainte de includerea în studiu și săptămânal dimineața în timpul studiului. La 30 de săptămâni după începerea studiului și la 4 luni de la ultima ședință de tratament, șobolanii au fost anesteziați cu hidrat de clor (300 mg/kg greutate corporală; C8383; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și uciși prin puncție aortică. Probele de țesut din fundul, ileonul distal, colonul proximal și partea distală a cornului uterin au fost colectate și prelucrate pentru evaluare histologică.
Pregătirea țesuturilor
Regiunea fundului/corpului stomacului, ileonului (începând de la 8 cm proximal către cecum și continuând în direcția proximală) și colonului (începând cu 2 cm distal față de cecum și continuând în direcția distală) au fost deschise și aplatizate pe hârtie de filtru . O secțiune din fiecare regiune intestinală a fost fixată în fixativul lui Stefanini (un amestec de 2% formaldehidă (Sigma-Aldrich) și 0,2% acid picric (Sigma-Aldrich) în tampon fosfat, pH 7,2) timp de 22 ore la 4 ° C și altă secțiune și coarnele uterine au fost fixate în paraformaldehidă 4% (Sigma-Aldrich) în tampon fosfat 0,1 M timp de 22 ore la 4 ° C. Specimenele fixate de Stefanini au fost clătite de trei ori în soluția Tyrode conținând zaharoză 10%, înainte de a fi orientate și montate pentru secționarea transversală și longitudinală în Tissue-Tek (Sakura, Histolab, Gothenburg, Suedia), înghețate pe gheață uscată și secționate (10 μm) într-un criostat (HM500; Microm GmbH, Walldorf, Germania). Probele fixate în paraformaldehidă au fost deshidratate în etanol, curățate în xilen, orientate pentru secțiuni transversale și longitudinale, încorporate în parafină și secționate (5 μm). Secțiunile au fost prelucrate pentru imunocitochimie și histochimie.