Trigliceridele tisulare, rezistența la insulină și implicațiile producției de insulină pentru hiperinsulinemie

Laboratoarele Gifford, Centrul pentru Cercetarea Diabetului, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Texas Southern Medical Center, Dallas 75235; și

Centrul Medical al Departamentului Veteranilor, Dallas, Texas 75216

Abstract

Conținutul de trigliceride tisulare (TG) părea să fie un candidat plauzibil pentru acest rol dublu. Acizii grași liberi cu lanț lung (FFA) se știu de multă vreme că interferează cu metabolismul glucozei mediat de insulină (2, 8, 13, 15,18, 24, 25, 29) și stimulează secreția de insulină acut (5, 11, 22, 26, 31). Mai mult, s-a demonstrat că nivelurile ridicate de FFA in vitro induc la insulele normale aceleași modificări descrise în celulele β compensatoare ale obezității, cum ar fi hiperplazia celulelor β și secreția crescută de insulină la niveluri de glucoză substimulatoare (16, 26). În al treilea rând, s-a arătat că insulele șobolanilor obezi hiperinsulinemici au un conținut de TG extrem de ridicat în comparație cu colegii normali de litiere (20).

Animale.

Toate animalele aveau vârsta de 7-9 săptămâni la începutul experimentelor. Șobolani obezi, prediabetici Zucker diabetici grași (ZDF)fa/fa) au fost crescuți în laboratorul nostru de la ZDF/Drt-fa (F10) stoc achiziționat de la R. Peterson (Facultatea de Medicină a Universității din Indiana, Indianapolis, IN). Șobolanii masculi au prezentat fenotipul descris anterior (30).

Șobolanii masculi Wistar cumpărați de la laboratoarele de reproducere Charles River (Wilmington, MA) au fost folosiți ca controale slabe cu hrană gratuită și controale restricționate pentru dietă. Șobolanii cu restricție dietetică au fost perechi de șobolani Wistar hrăniți la șobolanii lipopenici care supraexprimă leptina descriși în paragraful următor; aceasta a dus la o reducere de 42% a aportului lor caloric total.

Animalele hiperleptinemice, lipopenice, erau șobolani Wistar normali care primiseră o perfuzie de adenovirus recombinant conținând ADNc de leptină (AdCMV-leptină). După cum sa raportat anterior (3), ARNm de leptină a apărut în ficat în asociere cu o creștere a nivelului plasmatic de leptină și o reducere a aportului de alimente și a greutății corporale (vezi Fig. 1). Un alt grup de șobolani Wistar a fost perfuzat cu adenovirus care conține cADN-ul unei proteine irelevante, β-galactozidaza bacteriană (AdCMV-βGal), ca control al infecției virale.

Studii de transfer genic.

Pentru a clona ADNc de leptină de șobolan și a măsura ARNm-ul său, ARN-ul total a fost preparat din 1 g de țesut adipos epididimal al șobolanilor prin extracție cu TRIzol, așa cum a recomandat producătorul. Oligo (dT) a fost utilizat pentru a prepara sinteza de ADNc pe prima catenă utilizând un kit de sinteză a ADNc (Clontech, Palo Alto, CA). După tratamentul cADN-ului cu prima catenă cu ribonuclează fără dezoxiribonuclează, produsul genei leptinei a fost amplificat prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) cu grund de sens amonte 5'-GGAGGAATCCCTGCTCCAGC-3 'și grund antisens aval 5'-CTTCTCCTGAGGATACCTGG-3' pe secvența genei leptinei de șobolan (27). Atât pentru clonarea ADNc, cât și pentru măsurarea ARNm a leptinei, amplificarea a fost efectuată utilizând 1 ciclu la 94 ° C timp de 3 min, urmat de 35 de cicluri la 92 ° C timp de 45 s, la 53 ° C timp de 45 s și la 72 ° C timp de 1 min, apoi extinderea finală la 70 ° C timp de 10 min. De asemenea, am măsurat expresia β-actinei cu aceleași condiții de amplificare ca și pentru leptină și o pereche de oligonucleotide descrisă anterior (23).

Pentru a prepara virusul recombinant, un fragment PR de 640 bp conținând întreaga regiune de codificare a leptinei a fost ligat la pCR TM 2.1 (Invitrogen, San Diego, CA) conform protocolului producătorului. Analiza secvenței a confirmat că mai multe clone conțineau cpt ADN-ul leptinei intacte. ABamH I- șiXba Fragmentul de ADNc de leptină restricționat care a inclus 60 pb din regiunea netradusă 5 ′ și 76 pb din regiunea netradusă 3 ′ a fost ligat la pACCMVpLpA tratat în mod similar (10). Plasmida rezultată a fost cotransfectată cu pJM17 (23) în 293 celule prin coprecipitare de fosfat de calciu/ADN pentru a genera noul virus recombinant AdCMV-leptină prin utilizarea metodelor descrise anterior (1). ADN-ul virusului a fost izolat, iar prezența inserției genei leptinei a fost confirmată prin PCR utilizând primerii descriși mai sus și prin Southern blotting cu o oligonucleotidă (5′-GGATACCGACTGC GTGTGTGAAATGTCAT-3 ′) complementară ADNc-ului leptinei de șobolan. Stocurile de AdCMV-leptină au fost amplificate și purificate așa cum este descris (1) și depozitate la -70 ° C în soluție salină tamponată cu fosfat cu 0,2% albumină serică bovină (BSA) și 10% glicerol la 1-3 × 10 12 unități formatoare de plăci (pfu)/ml. Un virus care conține gena β-galactozidazei bacteriene sub controlul promotorului CMV, AdCMV-βGal, a fost preparat și utilizat așa cum s-a descris anterior (14).

Virusul a fost infuzat la șobolani Wistar masculi obținuți de la Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Înainte de studiile de perfuzie cu adenovirus, toți șobolanii primeau ad libitum șobolan standard (Teklad F6 8664, Madison, WI) și aveau acces gratuit la apă. Tubulatura din polietilenă (PE-50, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) a fost ancorată în artera carotidă stângă a șobolanilor Wistar în vârstă de 9 săptămâni de 250-300 g sub anestezie de sodiu pentobarbital (50 mg/kg, Abbott Laboratories North Chicago, IL) și exteriorizat printr-un tunel subcutanat. Tubulatura a fost umplută cu soluție salină heparinizată (1.000 U/dl) până când perfuzia de virus a început la 3 zile după operație. Înainte de perfuzie, probele de adenovirus au fost suspendate în soluție salină și filtrate printr-un filtru de 0,2 μm. Doi mililitri de AdCMV-leptină sau AdCMV-β-Gal conținând un total de 1 × 10 12 pfu au fost infuzați la animale anesteziate pe o perioadă de 1 oră. Animalele au fost studiate în cuști metabolice individuale (Nalgene, Rochester, NY), iar aportul de alimente și greutatea corporală au fost măsurate zilnic.

Măsurători plasmatice.

Începând cu o zi după perfuzia cu adenovirus, probele de sânge în post (1-3 PM) au fost colectate din vena cozii în tuburi capilare acoperite cu EDTA. Plasma a fost depozitată la -20 ° C până la momentul testării leptinei. Leptina plasmatică a fost testată folosind kitul de testare a leptinei Linco (Linco Research, St. Charles, MO). Insulina plasmatică a fost testată prin metode standard (37). Glucoza plasmatică a fost măsurată de Glucose Analyzer II (Beckman, Brea, CA).