Transplantul total de microbiote fecale ameliorează steatohepatita indusă de dietă bogată în grăsimi la șoareci prin
Subiecte
Abstract
Introducere
În special, părtinirea celulelor T care se infiltrează în ficat, împreună cu citokinele lor secretate, joacă un rol esențial în inflamația și progresia NASH 7. Între timp, microbiota intestinală joacă un rol esențial în menținerea homeostaziei sistemului imunitar adaptativ și reglează funcțiile celulelor T, care pot fi parțial atribuite metaboliților precum acizii grași cu lanț scurt (SCFA) 8,9,10. Astfel, am efectuat această explorare și am emis ipoteza că FMT va îmbunătăți ecosistemele microbiotei gastrointestinale, va regla metaboliții intestinali, cum ar fi acizii grași cu lanț scurt și va corecta dezechilibrul sistemului imunitar al ficatului, ducând la atenuarea dietei bogate în grăsimi (HFD) indusă steatohepatită și șoareci.
Materiale și metode
Experimente pe animale
Șoarecii C57BL/6 de sex masculin fără patogeni specifici (SPF) (SLAC animal co. De laborator, LTD, Shanghai, China) au fost adăpostiți în cuști cu eficiență ridicată, filtrate cu aer, cu așternut sterilizat și hrănite cu chow și apă autoclavizate ad libitum. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din spitalul Xinhua, care este afiliat la Școala de Medicină a Universității Shanghai Jiao Tong și toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu Ghidul Consiliului Național de Cercetare pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator.
Șoarecii au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri (12 șoareci per grup). Grupul de control a fost alimentat cu chow standard timp de 16 săptămâni. Grupul HFD a fost hrănit cu HFD (88% dietă standard, 10% untură de porc și 2% colesterol) timp de 16 săptămâni. Grupul HFD + FMT a fost alimentat cu HFD timp de 16 săptămâni și tratat cu FMT în ultimele 8 săptămâni. Toți șoarecii au primit o combinație de penicilină (2000 U/ml) și streptomicină (2 mg/ml) (Sigma Aldrich, SUA) în apa de băut timp de 3 zile pentru a elimina microorganismele intestinale indigene. După acest tratament, 200 mg de scaun proaspăt au fost colectate din grupul de control imediat după defecare și au fost resuspendate în 5 ml de soluție salină normală, vortexate timp de 3 minute și lăsate să se stabilească prin gravitație timp de 2 minute, iar scaunul proaspăt a fost colectat în fiecare zi . Transplantul în șoareci primiți a fost realizat prin gavaj cu 200 μl de supernatant din proba fecală o dată pe zi timp de 8 săptămâni 11 .
Fiecare șoarece a fost cântărit o dată pe săptămână și s-a calculat consumul săptămânal de alimente pe șoarece pentru diferitele grupuri. Șoarecii au fost sacrificați după 16 săptămâni, iar sângele de post din inimă a fost colectat. Țesutul hepatic, intestinul subțire, conținutul cecal și țesutul adipos epididimal de la fiecare șoarece au fost fie fixate într-o soluție de paraformaldehidă de 4%, congelate în gel de temperatură optimă de tăiere, fie congelate în azot lichid și depozitate la -80 ° C.
Analiza microbiană a fecalelor
Analize serice
Alanina aminotransferază (ALT), aspartatul aminotransferază (AST) și glucoza din sânge (FBG) au fost măsurate folosind un analizor automat (Sysmex CHEMIX-180, Japonia). Insulina serică (Kit ELISA pentru șobolani/șoareci, Merck-Millipore) a fost măsurată printr-un test imunosorbent legat de enzimă, concentrația de endotoxină de șoarece în ser a fost măsurată prin test imunosorbent legat de enzimă (Kit ET ELISA Mouse ET, Trust Speciality Zeal) și probe iar standardele au fost prelucrate conform instrucțiunilor producătorului. Evaluarea modelului de homeostazie a rezistenței la insulină (HOMA-IR) a fost calculată prin ecuația: FBG (mmol/L) × insulină (mU/L)/22,5. Indicele de sensibilitate la insulină (ISI) a fost calculat prin ecuația: 1/(FPG (mmol/L) × insulină (mU/L)).
Măsurători ale trigliceridelor și colesterolului în ficat
Trigliceridele intrahepatice (TG) și colesterolul au fost măsurate printr-un kit de testare a trigliceridelor sau un set de testare a colesterolului (Applygen Technologies Inc., Beijing, China). Probele și standardele au fost apoi prelucrate conform instrucțiunilor producătorului. Concentrațiile finale de trigliceride și colesterol au fost corectate pentru conținutul de proteine.
Analiza histologică
Secțiunile de parafină fixate în paraformaldehidă ale ficatului și intestinului subțire au fost colorate cu hematoxilină - eozină pentru analiză patologică sau cu colorare tricromă Masson pentru fibroză. Scorul de activitate a ficatului gras nealcoolic (NAS) a fost evaluat și secțiunile de ficat înghețate au fost colorate cu roșu ulei O. Pentru colorarea imumohistochimică, au fost utilizate secțiuni încorporate în parafină. S-a aplicat anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean și reacția a fost vizualizată de tetrahidroclorură de 3, 3'-diaminobenzidină. Diapozitivele au fost contracolorate cu hematoxilină. Zonele pozitive au fost cuantificate cu imaginea J2x. Anticorpii anti-Foxp3 și anti-ZO-1 au fost cumpărați de la Abcam (MA, SUA), iar IFN-γ, IL-4, IL-17 și IL-22 au fost achiziționați de la Bioworld (MN, SUA).
Reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (qPCR)
ARN-ul total a fost extras din ficat, intestin subțire sau grăsime epididimală folosind Trizol (D9108B, Takara, Dalian, China) și a fost transcris invers în ADNc folosind Primescript RT Master Mix (RR036A, Takara, Dalian, China). QPCR în timp real a fost efectuat pe un sistem PCR în timp real Applied Biosystems 7500 folosind SYBR Premix Ex Taq (Tli RnaseH Plus) (RR420A, Takara, Dalian, China). Grundele pentru genele țintă au fost sintetizate de Sangon Biotech (Shanghai, China). Secvențele primare pentru gene sunt enumerate în tabelul suplimentar 1. Specificitatea primerului a fost confirmată printr-o curbă de disociere utilizând software-ul SDS al sistemului 7500. Gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) a fost utilizată ca control intern.
Analiza Western blot
Ficatii au fost lizați în tampon de testare a imunoprecipitării la rece ca gheața (RIPA) care conține inhibitori de protează și fosfatază (fluorură de fenilmetilsulfonil, PMSF) (Beyotime, Shanghai, China). Proteina totală a fost măsurată prin metoda de analiză a proteinelor acidului bicinchoninic (BCA, Beyotime, Shanghai, China). Foxp3, IFN-γ, IL-4, IL-17, IL-22 și receptorul de insulină (IR, Abcam) din ficat au fost detectate și actina a fost utilizată ca control al încărcării. Complexe imune au fost detectate folosind substrat imobilon western chemiluminescent HRP (Millipore Corporation, Billerica, MA). Benzile au fost cuantificate prin Image Lab versiunea 2.0.1 (Bio-Rad, Hercules, CA).
Cuantificarea acizilor grași cu lanț scurt de conținut de cecal
Pentru a determina nivelul SCFA, s-a efectuat cromatografia lichidă de înaltă presiune (HPLC, Agilent 1200, Wilmington, DE, SUA). Pe scurt, soluțiile standard de acetat, propionat și butirat (toate de la Sigma-Aldrich) au fost preparate la diferite concentrații (3-6000 ng/ml). Aceste soluții au fost analizate utilizând HPLC, iar conținutul de cecal a fost dizolvat în acid formic 0,1% și analizat în mod similar pentru a măsura concentrația totală a tuturor celor trei acizi grași liberi 11 .