Tiroidita lui Hashimoto afectează implantarea embrionilor prin compromiterea morfologiei endometriale și
Abstract
fundal
Deși se crede că disfuncția tiroidiană cauzată de tiroidita Hashimoto (HT) este legată de eșecul implantării datorită subdezvoltării uterului receptiv, nu se știe dacă HT în sine, chiar și în starea eutiroidiană, afectează implantarea embrionului asociată cu defecte de receptivitate endometrială. Pentru a aborda dacă HT în sine poate afecta receptivitatea endometrială însoțită de modificări ale implantării, a fost stabilit un model HT eutiroidian la șoareci.
Metode
Șoarecii femele NOD au fost imunizați de două ori cu tiroglobulină și adjuvant pentru a induce modelul HT experimental. La patru săptămâni după al doilea tratament, șoarecii au fost în mod normal împerecheați, iar cei însărcinați au fost sacrificați în fereastra de implantare pentru măsurarea parametrilor tiroidieni și a hormonilor steroizi prin imunoanaliză electrochiluminiscentă și test imunosorbent legat de enzime și calculul numărului locului de implantare prin absorbția colorantului albastru Chicago . În plus, anumite caracteristici morfologice ale receptivității endometriale au fost observate prin colorarea hematoxilinei-eozină și microscopie electronică cu scanare, iar expresia altor markeri de receptivitate au fost analizate prin imunohistochimie, RT-qPCR sau Western Blot.
Rezultate
Șoarecii HT au prezentat infiltrare intratiroidiană de monocite și niveluri serice crescute de autoanticorp tiroidian fără disfuncție tiroidiană, definite ca HT eutiroidă la om. HT eutiroidian a avut ca rezultat eșecul implantării, mai puțini pinopode, maturarea pinopodului întârziată și inhibarea expresiei markerilor de receptivitate: receptorul de estrogen α (ERα), integrina β3, factorul inhibitor al leucemiei (LIF) și molecula de adeziune celulară-1 (ICAM-1). Interesant este că, în ciuda acestui răspuns de receptivitate endometrială compromis, nu au fost găsite diferențe statistice în nivelul serului de estradiol sau progesteron între grupuri.
Concluzii
Aceste descoperiri sunt primele care indică faptul că HT induce un mediu endometrial nereceptiv în starea eutiroidă, care poate sta la baza efectelor dăunătoare ale HT-ului însuși asupra implantării embrionului.
Introducere
Pentru a testa această ipoteză, acest studiu a construit un model clasic de șoarece HT [28] în care șoarecii femele NOD au fost imunizați activ cu tiroglobulina porcină (pTg) și au investigat dacă HT în sine a fost capabil să afecteze morfologia endometrului și expresia moleculară a endometrului gene legate de receptivitate însoțite de implantarea compromisă a embrionului în fereastra de implantare.
Materiale și metode
Reactivi și substanțe chimice
Tiroglobulina porcină (pTg), adjuvantul Freund complet (CFA) și adjuvantul Freund incomplet (IFA) au fost de la Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, SUA). Kitul TSH ELISA a fost de la Cloud-Clone Corp. (Wuhan, Hubei, China). Kituri E2 și P ELISA provin de la Cusabio Biotech Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China). Kitul de detectare SPlink a fost de la ZSGB-Bio (Beijing, China). Receptorii de estrogen α, integrina β3 și anticorpii GAPDH provin de la Abcam (Cambridge, MA, SUA). Receptorul de progesteron, anticorpii LIF, ICAM-1 provin de la Bioss, Inc. (Beijing, China). Reactivul TRI a fost de la Molecular Research Center, Inc. (Cincinnati, OH, SUA). Kituri de dezirribonuclează fără ribonuclează (DNază fără RNază) și kituri de transcripție inversă (RT) în timp real au fost de la Promega Corporation (Madison, WI, SUA). Light Cycler® 480 SYBR Green I Master Mix a fost de la Roche Diagnostics GmbH (Basel, Elveția). Toți ceilalți reactivi au fost cumpărați de la Sigma sau conform indicațiilor din metode.
Animale
Șoareci NOD (de 4 săptămâni, șoareci femele: 10
13 g; pisoi mici: 12
16 g) au fost achiziționate de la Nanjing Biomedical Research Institute din Nanjing University (numărul permisului: 15–0001). După 7 zile de carantină, toți șoarecii au fost ținuți în condiții specifice fără patogeni, cu acces ad libitum la apă și alimente în Centrul pentru animale de laborator al Universității de Medicină din Anhui (numărul permisului: 17–006). Toate procedurile la animale au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare stabilite de Centrul pentru Științe Animale de Laborator și Asociația Științelor Animalelor de Laborator de la Anhui Medical University.
Imunizarea și proiectarea experimentală
Imunoanaliză electrochiluminiscentă (ECLIA)
Toate probele de ser și țesut au fost conservate la - 80 ° C până la utilizare. În plus, țesuturile endometriale au fost omogenizate în 10 μl/mg PBS și apoi supernatanții au fost colectați prin centrifugare la 15.000 × g timp de 15 minute la 4 ° C. Concentrațiile de triiodotironină liberă (FT3), tetraiodotironină liberă (FT4), TPO-Ab și Tg-Ab în ser și în supernatantul omogenat endometrial au fost testate prin imunoanaliză electrochiluminiscentă (ECLIA) utilizând un analizor de chimie clinică Cobas e411 (Roche, Mannheim, Germania) . Kituri gratuite de triiodotironină, FT4, TPO-Ab și Tg-Ab ECLIA au fost achiziționate de la Roche Applied Science. Procedurile pentru ECLIA au fost descrise în detaliu în altă parte [29]. Rezultatele au fost determinate printr-o curbă de calibrare care a fost generată în mod specific de instrument prin calibrarea în 2 puncte și o curbă master furnizată prin intermediul codului de bare al reactivului. Datele sunt exprimate ca unități picomolare internaționale per gram de hormon și per miligram de proteine ale țesutului endometrial. Toate probele au fost rulate în duplicat și media a fost utilizată ca valoare de analiză finală pentru fiecare probă. Coeficienții de variație pentru testele acestor profiluri tiroidiene au variat între 7,38 și 14,22%.
Test imunosorbent legat de enzime (ELISA)
Probele de ser rămase au fost decongelate la temperatura camerei (18-25 ° C) pentru cuantificarea TSH, E2 și P în fiecare lună folosind kiturile lor ELISA respective conform instrucțiunilor producătorului. Pentru valoarea densității optice (OD), absorbanța culorii din plăci a fost măsurată la 450 nm de către un cititor BioTek (Biotek Winooski, Vermont, SUA). Datele sunt exprimate ca picograme sau nanograme pe mililitru de hormon seric. Toate probele au fost rulate în duplicat și media a fost utilizată ca valoare de analiză finală pentru fiecare probă. Coeficienții de variație pentru testele hormonilor steroizi și TSH au variat între 7,24 și 9,84%.
Colorarea hematoxilinei și eozinei (HE) și imunohistochimie (IHC)
Glandele tiroide proaspăt colectate și uterele au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 24 de ore pe un agitator și apoi încorporate în parafină. Din fiecare țesut încorporat în parafină, au fost secționate serial felii coronale (3 μm grosime). Feliile de tiroidă colorate cu hematoxilină și eozină (HE) au fost cuantificate pentru zona de infiltrare a celulelor mononucleare tiroidiene în conformitate cu un studiu anterior [30]: 0 = fără infiltrare; 1 = una sau două interstiții foliculare acumulate de celulele inflamatorii; 2 = una sau două leziuni celulare inflamatorii care ating dimensiunea foliculară; 3 = 10-40% infiltrare celulară inflamatorie; 4 = mai mult de 40% infiltrare celulară inflamatorie. În plus, colorarea HE a endometrului a fost analizată pentru observarea morfologică folosind un microscop Olympus DP80 (Olympus, Tokyo, Japonia). În fiecare uter, cel puțin 3 secțiuni necontigue au fost selectate aleator pentru a calcula numărul de glande (mărire 40 ×).
Imunohistochimia (IHC) a fost efectuată folosind setul de detectare SPlink. Secțiunile de uter cu grosimea de cinci micrometri au fost montate pe lamele, deparafinizate și rehidratate prin xilen și o serie de alcool gradat. După fiecare etapă, secțiunile au fost clătite de 3 ori cu PBS (câte 3 minute). După stingerea activității peroxidazei endogene cu 3% peroxid de hidrogen timp de 10 min, recuperarea antigenului a fost efectuată prin aburirea secțiunilor în tampon citrat 0,01 M (pH 6,0) timp de 20 min. Siturile de legare nespecifice au fost blocate cu 5% ser normal de capră timp de 30 de minute înainte de anticorpii primari specifici împotriva ERα (ab96867, 1: 250) și PR (bs23376R, 1: 500), peste noapte la 4 ° C. Diapozitivele au fost incubate timp de 30 de minute cu capră biotinilată IgG anti-iepure, urmată de incubare de 45 de minute cu complex avidină-biotină marcat cu peroxidază de hrean. Imunomarcarea a fost dezvoltată prin aplicarea diaminobenzidinei. Diapozitivele au fost contracolorate cu hematoxilină, deshidratate și montate folosind mediu de montare.