Test imunosorbent legat de enzime sandwich pentru detectarea semințelor de susan în alimente

1 Program de cercetare și resurse în domeniul alergiei alimentare, Departamentul de Știință și Tehnologie Alimentară, Universitatea din Nebraska, Lincoln, NE 68588-6207, SUA

2 Ministerul Agriculturii și Afacerilor Rurale, Direcția pentru Controlul Alimentelor și Cercetarea Alimentară Centrală, 16036 Bursa, Turcia

Abstract

1. Introducere

Reacțiile alergice la ingestia de semințe de susan pot fi declanșate de doze de până la 1 mg de proteine din semințe de susan pentru cazuri individuale, iar studiul pragului populației a arătat că aproximativ 5 mg de proteine din semințe de susan declanșează o reacție în 10% din semințele de susan. -populația alergică [5]. Semințele de susan conțin mai multe proteine alergenice care au fost identificate și parțial caracterizate [6-9]. Uleiul de susan poate prezenta, de asemenea, un pericol pentru persoanele alergice la semințe de susan, deoarece nu este adesea foarte rafinat și conține astfel reziduuri de proteine [10].

2. Materiale și metode

2.1. Prepararea imunogenului

2.2. Producția de anticorpi policlonali

O capră a fost imunizată cu 1,0 mg de imunogen degresat de semințe de susan emulsionat cu CFA și administrat subcutanat (s.c.). Prima injecție de rapel, compusă din 500 μg imunogen de semințe de susan în IFA, a fost administrat la 2 săptămâni după imunizarea inițială. Injecțiile de rapel ulterioare au fost administrate cu 250 μg de semințe de susan degresate în IFA la fiecare 3 săptămâni după aceea, alternând între s.c. și intramuscular (i.m.). Prima sângerare de test a fost luată după a doua injecție de rapel (aproximativ 5 săptămâni după injecția inițială), iar ulterior sângerările de test au fost luate la 10 zile după fiecare injecție de rapel.

Trei pui au fost inițial imunizați cu imunogen degresat din semințe de susan în CFA, urmat de injecții de rapel la intervale de 2 săptămâni folosind 200 μg în IFA (s.c. și i.m., alternativ) practic conform Schade și colab. [15]. La opt săptămâni după imunizarea inițială, acest grup a fost odihnit timp de aproximativ 6 săptămâni, iar apoi injecțiile de rapel au fost schimbate la intervale de 3 săptămâni din cauza unei scăderi observate a producției de anticorpi.

Dezvoltarea titrului a fost monitorizată folosind un ELISA necompetitiv, practic descris de Hefle și colab. [16]. Pe scurt, plăcile de microtitrare (MaxiSorp, Nagle Nunc International, Roskilde, Danemarca) au fost acoperite cu 1 μg proteine din semințe de susan/ml tampon de acoperire (0,015 M Na2CO3, 0,035 M NaHCO3 și 0,02% NaN3, pH 9,6) și incubate peste noapte la 4 ° C. După blocare cu 350 μL de PBS conținând 0,1% gelatină (porcine, 300 de flori, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), seruri din gălbenușuri de capră sau de pui au fost incubate în diferite diluții. Plăcile au fost spălate cu PBS conținând 0,05% Tween 20, iar IgG de capră legat și IgY de ou au fost detectate și cuantificate folosind conjugate comerciale anti-imunoglobulină-fosfatază alcalină (anti-capră IgG [Pierce Chemical Co., Rockford, IL]; anti-pui IgY [Promega Co., Madison, WI]), respectiv, urmând instrucțiunile producătorului. Sângerările de la capră cu titruri peste 10.000 au fost combinate. Gălbenușurile cu titruri> 3.000 au fost reunite.

2.3. Izolarea anticorpilor

Anticorpii policlonali IgG au fost parțial purificați din ser prin precipitare în 50 și 35% sulfat de amoniu [16]. IgG parțial purificat a fost scurt dializat împotriva apei deionizate și apoi a fost dializat extensiv împotriva soluției saline tamponate cu fosfat 0,01 M (PBS) (0,002 M NaH2PO4, 0,008 M Na2HPO4, 0,85% NaCl și 0,02% NaN3, pH 7,4) așa cum este descris de Hefle et. al. [16]. Această fracțiune IgG a fost utilizată ca anticorp de acoperire pentru dezvoltarea ELISA. Ouăle imune au fost colectate și depozitate la 4 ° C până la nevoie. Fracția IgY a fost purificată utilizând un sistem comercial de purificare EGGstract IgY (Promega Co., Madison, WI). Preparatele de imunoglobulină Y au fost depozitate la -20 ° C până la nevoie. Această fracțiune IgY a fost utilizată ca anticorp de detectare în dezvoltarea ELISA. Conținutul de proteine al fracțiilor IgG (48,5 mg/ml) și IgY (7,7 mg/ml) a fost determinat prin metoda Lowry [17].

2.4. Electroforeza pe gel și imunoblotarea

2.5. Sandwich ELISA

2.6. Curba standard pentru Sandwich ELISA

Curbele standard au fost construite cu extracte de amestec de pâine cu vârfuri cunoscute de susan sub formă de făină de semințe de susan. Apoi, 454 grame de amestec de pâine uscată (Hodgson Mills, lotul 10 07 09 2) au fost amestecate cu cantitatea necesară de făină de semințe de susan pentru a obține 1.000 ppm în rețeta finală. Această cantitate va avea ca rezultat o concentrație de 0,01% sau 100 ppm după adăugarea celorlalte ingrediente (greutatea totală de 742 g). Alte 454 de grame de amestec de pâine uscată au servit drept control negativ. La 454 grame amestec de pâine uscată, s-au adăugat 30 grame ulei vegetal, 6 grame drojdie proaspătă și 252 grame apă, rezultând o greutate totală de 742 grame. Extractele au fost făcute din amestecul de pâine cu pâine cu 1000 ppm și amestec de pâine cu pâine cu 0 ppm (așa cum este descris mai jos) și aceste extracte au fost amestecate în diferite rapoarte pentru a obține diluțiile necesare pentru curba standard. Curbele standard au fost generate utilizând software-ul grafic Prism (GraphPad Prism, Inc., San Diego, CA).

2.7. Comparație cu testele comerciale de semințe de susan

Kituri ELISA disponibile comercial pentru semințe de susan au fost obținute de la Tepnel Biokits (Deeside, Marea Britanie) și ELISA Systems (Windsor, Australia). Testele au fost furnizate ca kituri gata de utilizare, cu toți reactivii, diluanții și standardele incluse și au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului. Testul Tepnel Biokits a avut un domeniu de detectare revendicat de la 6 la 100 ppm, testul ELISA Systems de la 0,5 la 5 ppm. Extractele au fost pregătite conform instrucțiunilor producătorilor de truse.

2.8. Mostre alimentare

Toate probele de alimente au fost achiziționate de la comercianții cu amănuntul locali din Lincoln, Nebraska. Nouăzeci și șapte de alimente sau ingrediente alimentare au fost evaluate pentru reactivitatea încrucișată și efectele matricei în ELISA. Toate probele au fost măcinate la consistență uniformă utilizând un blender Oster (Oster Professional Products, Chicago, IL) sau un mortar și pistil în funcție de textura probelor.