Reglarea diferențială indusă de acidul gras a genelor care codifică proliferatorul activat al peroxizomului

Abstract

Scopuri/ipoteze

Coactivatorul transcripțional al receptorului activat cu proliferatorul peroxizomului-γ coactivatorul-1α (PGC-1α) îmbunătățește căile relevante din punct de vedere metabolic, cum ar fi gluconeogeneza, oxidarea acizilor grași, termogeneza, fosforilarea oxidativă și biogeneza mitocondrială. Deoarece reglarea expresiei genei care codifică PGC-1α (PPARGC1A) prin nutrienți/metaboliți nu a fost evaluat în detaliu, scopul acestui studiu a fost de a determina dacă PPARGC1A (și PPARGC1B) expresia este modulată de acizi grași de plasmă obișnuiți în celulele musculare scheletice umane.

Metode

Miotuburile umane care fuseseră diferențiate in vitro au fost tratate cu miristat de 0,5 mmol/l (C14: 0), palmitat (C16: 0), stearat (C18: 0), palmitoleat (C16: 1-7), oleat (C18: 1ω9) sau linoleat (C18: 2ω6). PPARGC1A/ ARNm a fost cuantificat prin RT-PCR. Activitatea mitocondrială a fost determinată de formarea formazanului.

Rezultate

Celulele netratate au exprimat de 28 de ori mai mult PPARGC1B mARN decât PPARGC1A ARNm (13,33 ± 2,86 vs 0,47 ± 0,08 fg/μg ARN total, = 5). PPARGC1A expresia a fost crescută de două până la trei ori de către toți acizii grași nesaturați (UFA) testați

Introducere

PGC-1β, omologul structural cel mai apropiat de PGC-1α, este codificat de o genă separată și prezintă o distribuție tisulară similară. Rolul jucat de PGC-1β nu este bine înțeles, dar o suprapunere funcțională semnificativă cu PGC-1α este sugerată de faptul că ambele proteine sunt, cel puțin parțial, capabile să coactiveze aceiași factori de transcripție și să inducă expresia unui set similar de gene țintă. Cu toate acestea, descoperirile noi la gemeni indică, de asemenea, diferențe funcționale, PGC-1β fiind mai importantă în β-oxidarea mitocondrială [4].

Datele privind reglarea acestor doi coactivatori transcripționali de către nutrienți și metaboliți sunt rare. Astfel, scopul acestui studiu a fost de a determina dacă NEFA-urile comune din plasmă, care sunt fie derivate din dietă, fie sunt eliberate lipolitic din depozitele de trigliceride, modulează expresia PPARGC1A și PPARGC1B in celulele musculare scheletice umane in vitro.

Subiecte, materiale și metode

Cultură de celule

Celulele musculare scheletice primare umane au fost obținute din biopsiile cu ac ale mușchiului vastus lateralis și crescute și diferențiate, așa cum s-a descris anterior [5]. În ziua 5 de diferențiere, celulele au fost tratate fie cu BSA fără acizi grași (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania), ca martor, fie cu 0,5 mmol/l NEFA (Sigma-Aldrich) legat de BSA. Soluții stoc (8 mmol/l) de mirat (C14: 0), palmitat (C16: 0), palmitoleat (C16: 1ω7), oleat (C18: 1ω9) și linoleat (C18: 2ω6) și un 4-mmol/S-au preparat soluție stoc de stearat (C18: 0) în tampon Krebs - Ringer - HEPES conținând 20% BSA prin agitare peste noapte la 37 ° C sub azot. Donatorii de celule musculare au fost recrutați din studiul familiei Tuebingen pentru diabetul de tip 2 și au dat consimțământul scris în cunoștință de cauză studiului. Studiul a fost aprobat de comitetul etic local.

RT-PCR în timp real

Celulele au fost tratate timp de 20 de ore, apoi spălate și recoltate prin tripsinizare. ARN-ul a fost izolat cu coloane RNeasy (Qiagen, Hilden, Germania). ARN total tratat cu DNază I fără RNază a fost transcris în ADNc folosind transcriptaza inversă AMV și trusa de sinteză a ADN-ului First Strand de la Roche Diagnostics (Mannheim, Germania). PCR cantitativă a fost efectuată în triplicat cu SYBR Green pe un LightCycler (Roche Diagnostics) folosind următorii primeri (Invitrogen, Karlsruhe, Germania): PPARGC1A: înainte 5'-TGTGCAACTCTCTGGAACTG-3 ', invers 5'-TGAGGACTTGCTGAGTGGTG-3'; PPARGC1B: înainte 5'-GCTCTCCTCCTTCTTCCTCA-3 ', invers 5'-ATAGAGCGTCTCCACCATCC-3'; ARNr 28S: înainte 5'-ACGGCGGGAGTAACTATGACT-3 ', invers 5'-CTTGGCTGTGGTTTCGCT-3'. Condițiile PCR au fost următoarele: PPARGC1A ARNm: temperatura de recoacere 65 ° C, 45 cicluri; PPARGC1B ARNm: temperatura de recoacere 68 ° C, 45 cicluri; 28S temperatura de recoacere a ARNr 63 ° C, 50 cicluri (MgCl2 în toate reacțiile 4 mmol/l).

Determinarea activității mitocondriale

După tratament, celulele cultivate în duplicat au fost incubate timp de 4 ore cu 0,5 mg/ml bromură de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazoliu (MTT) înainte de liza peste noapte prin adăugarea a două volume de 10% SDS în 0,01 mol/l HCI. A fost utilizat kitul de proliferare celulară I (MTT) de la Roche Diagnostics. Lizatele au fost transferate în tuburi, agitate și apoi colorantul formazan produs de dehidrogenazele mitocondriale a fost măsurat fotometric la 565 nm.

Rezultate

Miotuburile umane diferențiate in vitro netratate au exprimat niveluri scăzute, dar detectabile în mod constant PPARGC1A ARNm (0,47 ± 0,08 fg/μg ARN total, = 5). Nivele de PPARGC1B ARNm au fost de 28 de ori mai mari în aceleași celule (13,33 ± 2,86 fg/μg ARN total, = 5).