Reglarea ciclului celular și remodelarea cito-scheletului sunt procese critice în nutriție

Affiliation School of Biosciences, Universitatea din Nottingham, Sutton Bonington, Loughborough, Regatul Unit

Afiliere Rowett Institute of Nutrition and Health, Universitatea din Aberdeen, Aberdeen, Regatul Unit

Affiliation School of Biosciences, Universitatea din Nottingham, Sutton Bonington, Loughborough, Regatul Unit

Angelina Swali,
Sarah McMullen,
Helen Hayes,
Lorraine Gambling,
Harry J. McArdle,
Simon C. Langley-Evans

Cifre

Abstract

Multe mecanisme presupun explicarea modului în care semnalele nutriționale din timpul dezvoltării timpurii se manifestă ca boală la descendenții adulți. În timp ce acestea descriu procesele care conduc de la insulta nutrițională la dezvoltarea patologiei reale, cauza inițială care stă la baza efectului de programare rămâne evazivă. Pentru a stabili principalele motoare de programare, acest studiu a urmărit să capteze modificările embrionare ale genelor și proteinelor în întregul embrion în momentul insultei nutriționale, mai degrabă decât efectele fenotipice din aval. Prin utilizarea unui design încrucișat a două modele bine stabilite de restricție a proteinelor materne și a fierului, ne propunem să identificăm „purtătorii de poartă” comuni putabili care pot conduce la programarea nutrițională.

Atât carența de proteine, cât și cea de fier în utero au redus complementul nefronic la șobolanii masculi adulți Wistar și Rowett Hooded Lister (P2 Profiler PCR Array for Rat Cell Cycle (SABiosciences) a fost efectuată ca validare ulterioară în aceste patru grupuri. 500 ng de ARN embrionar preparat anterior din grupurile RHL (CP, MLP, FeC și FeD; n = 6 pentru fiecare) a fost transcris invers utilizând un kit RT 2 First Strand (SABiosciences). PCR în timp real a fost efectuat pe ADNc în amestec verde SYBR în plăci matrice de 384 de godeuri personalizate să analizeze expresia a 84 de gene cheie pentru reglarea ciclului celular și gene de menaj.

Proteomica.

Analize statistice.

Numărul total de nefron, modificările expresiei genelor și aria și densitatea spotului proteic au fost comparate între grupurile de dietă/tulpină prin ANOVA unidirecțională în SPSS v16.0. În cazul unui rezultat semnificativ ANOVA (P Tabelul 1. Greutatea la naștere la bărbați, greutatea corporală de 16 săptămâni, greutatea renală stângă de 16 săptămâni și raportul greutate rinichi-corp.

La ambele tulpini de șobolani, proteine prenatale (Wistar: P Figura 1. Numere de nefron în fiecare dietă/grupă de tulpini.

Datele sunt medii ± SE. * P Tabelul 2. Numărul de gene reglate în sus și în jos cu fiecare insultă dietetică comparativ cu controlul său, în fiecare tulpină de șobolan (n = 8 animale pe grup; RHL - Rowett Hooded Lister, MLP - proteine scăzute materne, FeD - deficit de fier).

Analiza căii.

Analiza căii a fost efectuată folosind platforma MetaCore pentru a identifica procesele funcționale care au fost perturbate de expunerea embrionului la subnutriția maternă. Această analiză s-a bazat exclusiv pe genele supuse gatekeeper identificate din microarrays (Tabelul S2a - d). Nu au existat suficiente gene Wistar gatekeeper specifice pentru a găsi căi comune restricțiilor de proteine și fier prenatale în această tulpină. Cu toate acestea, pentru RHL, cele mai semnificative căi s-au referit la remodelarea citoscheletului, procesele ciclului celular, apoptoza, transducția semnalului, metabolismul glicogenului și procesele de dezvoltare (Figura S1a). Ambele tulpini de șobolan expuse restricției prenatale de proteine au împărțit căi preocupate de semnalizarea fantei-robo, formarea veziculelor acoperite cu clatrin, aderența celulară și din nou remodelarea citoscheletului (Figura S1b). Pentru deficitul de fier, ambele tulpini de șobolan au prezentat modificări ale căilor comune în conformitate cu cele raportate pentru RHL și restricția proteinelor (formarea veziculelor acoperite cu clatrin, remodelarea citoscheletului, aderența celulelor și procesele de dezvoltare), pe lângă formarea endosomilor, transcripția, contracția musculară și imunitatea răspuns (Figura S1c).

Analiza căilor a identificat, de asemenea, factori de transcripție care au format „hub-uri” în căile comune. O listă a fost construită din gene asociate cu aceste hub-uri și acest lucru a fost încrucișat cu lista genelor identificate ca putative gatekeepers din microarray. Un total de 36 de gene au apărut pe ambele liste și acestea au fost considerate cele mai importante ținte genetice pentru activitatea de urmărire. În plus, au fost selectați ca ținte 4 factori de transcripție care au format „hub-uri” importante în analiza căii.

PCR în timp real.

Analiza PCR în timp real a celor 36 de ținte genetice și a 4 factori de transcripție identificați în analiza microarray și a căilor nu a reușit în general să demonstreze semnificația statistică a rezultatelor microarray, deși modificările au arătat un acord general (tabelele 3 și 4). Dintre cele treizeci și șase de gene selectate, șaisprezece s-au arătat prin PCR că sunt reglate în sus sau în jos cu aceeași direcție de schimbare indicată de microarray, în ambele insulte dietetice într-o tulpină sau aceeași insultă în ambele tulpini. Dintre acestea, o genă, Ube2c, a demonstrat o descreștere semnificativă (aproximativ 50%) atât pentru restricția de fier, cât și de proteine la embrioni din sarcinile cu RHL. Alte patru dintre aceste șaisprezece gene (Acvr2b, Nufip1, Rps20 și Taf13) au prezentat modificări semnificative între una dintre cele două perechi din grup. De exemplu, Nufip1 a fost semnificativ reglat în jos în MLP vs CP în RHL (P Tabelul 3. Exprimarea selecției genelor de microarray în țesutul embrionar analizat prin PCR în timp real ca răspuns la deficiența de fier atât la șobolanii Wistar, cât și la cei de la Rowett Hooded Lister (FC = schimbare ori, RHL = Rowett Hooded Lister).

Șaisprezece din cele treizeci și șase de gene au fost de acord cu microarray-ul pentru una dintre perechile din grup, două semnificativ, dar au arătat direcția opusă de schimbare în cealaltă pereche (din nou, o verificare parțială a studiului microarray). Doar patru din cele treizeci și șase de gene au prezentat modificări de expresie care se aflau în direcția opusă microarrayului (Cyclin H, Mcart1, TBX3 și Tomm20). Patru gene (Eef1g, Hint1, Rnf7 și Stx12) au fost sugerate prin analiza PCR în timp real pentru a fi gatekeeperi pentru un grup diferit de cel identificat inițial prin microarray (RHL gatekeepers, mai degrabă decât restricții de fier gatekeepers). Două dintre acestea (Hint1 și Rnf7) au prezentat acum modificări semnificative între RHL CP și MLP. Cei patru factori de transcripție care au fost selectați din analiza căii și măsurați prin PCR în timp real (SP1, C-Myc, HNF4a și p53) au arătat toți modificări unidirecționale în expresie, atât cu insulte dietetice la șobolani RHL, cât și modificări ale expresiei abordate semnificație statistică pentru cel puțin una dintre insultele dietetice în fiecare caz (P Tabelul 5. Selectarea datelor privind expresia genelor din RT 2 Profiler Rat Cell Cycle PCR Array (FC = fold-change, RHL = Rowett Hooded Lister).