Producția stabilă de tetrodotoxine de către Bacillus sp

Daria I. Melnikova

1 А.В. Centrul Național Științific Zhirmunsky de Biologie Marină, Filiala Orientului Îndepărtat, Academia Rusă de Științe, Vladivostok 690041, Rusia; ur.ovd.bmi@avokinlemd (D.I.M.); ur.ovd.bmi@oknesalva (A.E.V.)

Anna E. Vlasenko

Timur Yu. Магарламов

2 Școala de biomedicină, Universitatea Federală din Orientul Îndepărtat, Vladivostok 690090, Rusia

Abstract

Pentru prima dată, tetrodotoxina (TTX) a fost detectată într-o tulpină bacteriană după cinci ani de cultivare în condiții de laborator de la izolarea sa de gazda animalului. O metodă fiabilă potrivită pentru probe bacteriene, cromatografie lichidă de înaltă performanță cu spectrometrie de masă tandem, a fost utilizată pentru detectarea toxinei în culturi de spori și vegetative de Bacillus sp. 1839. TTX a fost detectat într-o cultură de spori a tulpinii.

1. Introducere

Tetrodotoxina (TTX), fiind una dintre cele mai renumite neurotoxine cu greutate moleculară mică, capabile să blocheze canalele de sodiu cu tensiune în țesuturile nervoase și musculare, a fost găsită într-o mare varietate de organisme marine și terestre și sedimente marine și de apă dulce [1]. Originea sa în organisme și ecosisteme este încă o problemă controversată, dar descoperirea a numeroase tulpini bacteriene capabile să producă TTX izolate din sursele menționate mai sus indică legătura dintre apariția bacteriilor și a toxinei. Existența unei tulpini bacteriene dovedită a produce TTX independent de organismul gazdă poate facilita dramatic descoperirea căilor încă necunoscute ale biosintezei TTX. Cu toate acestea, una dintre principalele preocupări asociate cu bacteriile producătoare de TTX este incapacitatea celor mai multe bacterii găsite de a produce toxine prin cultivare îndelungată sau chiar după mai multe treceri [2]. O altă întrebare importantă este metoda de detectare TTX. În ciuda diferitelor abordări metodologice bazate pe specificitatea antigenului, efectul neurotoxic sau proprietățile fizico-chimice ale toxinei utilizate de cercetările din studiile cu bacterii, numai cromatografia lichidă cu spectrometrie de masă tandem ar putea fi considerată cea mai specifică și de încredere până în prezent [1].

Grupul nostru de cercetare a lucrat pe problema distribuției TTX în ecosistemele marine, cu un accent deosebit pe screeningul producătorilor de bacterii TTX timp de câțiva ani. Căutarea bacteriilor producătoare de TTX în viermele cu panglică toxică Cephalothrix simula folosind TTX folosind microscopie confocală cu scanare laser cu anticorpi policlonali anti-TTX, desfășurată în 2014, a dezvăluit o etichetare TTX-pozitivă în celulele bacteriene ale tulpinii Bacillus [3]. Investigație detaliată a Bacillus sp. tulpina 1839 utilizând microscopie imunoelectronică cu anticorpi anti-TTX a arătat o asociere strictă a marcării TTX cu endospori și spori liberi de bacterii [4]. Investigații suplimentare privind ciclul de viață [5] și condițiile de sporulare [6] au arătat că tulpina a fost TTX-pozitivă chiar și după numeroase pasaje timp de trei ani de la descoperirea sa, care, în combinație cu sinteza TTX asociată cu sporii, o face unică printre altele Bacterii producătoare de TTX. Acest lucru indică importanța confirmării producției TTX de către Bacillus sp. 1839 prin metode mai fiabile de detectare a toxinelor.

Cercetările actuale sunt primul raport al sintezei TTX de către bacterii după cinci ani de la izolare. TTX a fost dezvăluit în cultura de spori a Bacillus sp. tulpina 1839 folosind cromatografie lichidă de înaltă performanță cu spectrometrie de masă tandem (HPLC-MS/MS).

2. Rezultate

Ca rezultat al analizei HPLC-MS/MS a sporului și a culturii vegetative a Bacillus sp. 1839, TTX a fost detectat (Figura 1 A, Tabelul 1). Toxina a fost găsită numai în cultura de spori a tulpinii. Spectrul de fragmentare MS/MS al Bacillus sp. Extractul din cultura de spori din 1839 a prezentat fragmente caracteristice de ioni de precursor TTX (M + H) + m/z 320: (M + H-H2O) + la m/z 302 și (M + H-C3H7O6) + la m/z 162 Figura 1 B).