Pregătirea în față a vaselor de sânge de șoarece
Kyung Ae Ko
1 Departamentul de Cardiologie, Divizia de Medicină Internă, Universitatea din Texas MD Anderson Cancer Center
Keigi Fujiwara
1 Departamentul de Cardiologie, Divizia de Medicină Internă, Universitatea din Texas MD Anderson Cancer Center
Sunil Krishnan
2 Departamentul de Oncologie a Radiațiilor, Universitatea din Texas MD Anderson Cancer Center
Jun-ichi Abe
1 Departamentul de Cardiologie, Divizia de Medicină Internă, Universitatea din Texas MD Anderson Cancer Center
Abstract
Secțiunile de țesuturi încorporate în parafină sunt utilizate în mod obișnuit pentru studierea histologiei și histopatologiei țesuturilor. Cu toate acestea, este dificil să se determine care este morfologia tridimensională a țesutului din astfel de secțiuni. În plus, secțiunile de țesuturi examinate pot să nu conțină regiunea din țesut care este necesară în scopul studiului în curs. Această ultimă limitare împiedică studiile histopatologice ale vaselor de sânge, deoarece leziunile vasculare se dezvoltă în mod focalizat. Acest lucru necesită o metodă care să ne permită să analizăm o zonă largă a peretelui vaselor de sânge, de la suprafața sa până la regiunile mai adânci. O pregătire completă a vaselor de sânge în față îndeplinește această cerință. În acest articol, vom demonstra cum să facem preparate în față ale aortei șoarecelui și ale arterei carotide și să le colorăm imunofluorescent pentru microscopie confocală și alte tipuri de imagistică bazată pe fluorescență.
Introducere
Preparatele de montare completă în față (pronunțate än ˈfäs) ne permit să analizăm o zonă largă a suprafeței vaselor de sânge, cum ar fi întreaga aortă de la rădăcina aortică până la arterele iliace comune. Folosind un astfel de specimen colorat cu anticorpi specifici și alte sonde specifice, se poate identifica localizarea leziunilor și, de asemenea, în cazul în care apar diferite evenimente moleculare în celulele endoteliale coroborate cu aterogeneză, cum ar fi modificări de exprimare, localizare și modificări posttranslaționale ale proteinelor. În plus față de studierea aterogenezei, forma celulei endoteliale observată în preparatele pentru față este utilizată ca indicator al modelului regional al fluxului sanguin mediat în timp. Astfel de date sunt importante pentru studierea in situ a mecanosemnalizării celulelor endoteliale. În acest scop, vasele de sânge histologice de secțiune transversală de rutină nu sunt utile. Astfel, pentru medicina vasculară și biologie, este deosebit de important să se dobândească o tehnică pentru realizarea preparatelor de față a vaselor de sânge care să permită observarea unei zone largi a suprafeței vasului, precum și a zonelor subterane mai adânci ale vasului.
În acest articol, vom ilustra o metodă pentru prepararea preparatelor de față ale aortei de șoarece și ale arterei carotide pentru colorarea imunofluorescentă. Pregătirile în față se pot face chiar și după ce aceste vase au fost manipulate experimental. De exemplu, o arteră carotidă poate fi parțial ligată și apoi se poate face un preparat facial după o astfel de intervenție chirurgicală. Din acest motiv, vom descrie și în acest articol cum facem o ligatură parțială pe artera carotidă. Comparativ cu prepararea unor preparate similare de la animale mai mari, cum ar fi șobolani, iepuri și oameni, vasele de șoareci sunt de dimensiuni mici și mai fragile, necesitând astfel o îngrijire suplimentară pentru manipulare în timpul izolării chirurgicale a vaselor și pregătirea acestora pentru colorarea anticorpilor și microscopie. Deoarece modelul animal cel mai frecvent utilizat pentru modificarea genetică este șoarecele, devine esențial pentru mulți anchetatori să manipuleze vasele de șoarece fără a le deteriora. În acest manuscris, vom descrie cum să se ocupe de vasele de sânge ale șoarecilor atunci când se fac preparate în față ale aortei șoarecelui și ale arterei carotide. În scopul demonstrării, vom folosi șoareci de tip sălbatic C57/b6.
Protocol
Protocoalele pentru ligarea parțială a arterei carotide și izolarea mouse-ului aortei și a arterei carotide de șoarece pentru imunocolorarea în față sunt aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IBT 2014-9231).
1. Legătură parțială stângă a arterelor carotide
Pregătiți spațiul chirurgical așezând un tampon de încălzire de 12 inch x 14 inch pe masă și acoperiți tamponul și blatul mesei cu un draperie chirurgicală mare și curată. Reglați brațul suportului brațului astfel încât câmpul vizual al stereomicroscopului să fie în zona centrală a plăcii de încălzire.
Porniți plăcuța de încălzire de pe masă și setați selectorul de control cu 3 setări la nivelul mediu de căldură. La această setare a temperaturii, suprafața plăcii chirurgicale (vezi 1.6.1) va fi de 38-40 ° C.
Așezați o cușcă curată pe un alt tampon de încălzire. Porniți plăcuța de încălzire ca mai sus. Această cușcă va fi utilizată pentru recuperare după operație (vezi 1.16), precum și pentru adăpostire.
Pe masa chirurgicală, așezați o pungă de sterilizare autoclavată care conține foarfece de iris (1 pereche), forceps pentru țesut (1 pereche), forceps super grip (2 perechi), foarfece cu arc (1 pereche), retractor bont (1 pereche; 2,5 mm lățime), suport rotund cu ac cu mâner (1), sutură de mătase sterilizată 6-0, aplicatoare cu vârf de bumbac, mini aplicatoare cu vârf de bumbac, draperii chirurgicale și bureți de tifon de 2 "x 2". De asemenea, așezați o sticlă de stoarcere conținând 70% etanol și o altă sticlă care conține clorhexidină chirurgicală pe masa chirurgicală.
Cântărește un șoarece. Greutatea corporală este necesară pentru a determina cantitatea adecvată de analgezie, care va fi administrată imediat înainte de operație.
Așezați un mouse în camera de inducție.
Porniți rezervorul de oxigen și vaporizatorul anestezic pentru a anestezia mouse-ul din camera de inducție. Mențineți nivelul de izofluran la 2%. Durează 3-5 minute până când mouse-ul nu se mai mișcă.
În timp ce mouse-ul este anesteziat, plasați o bucată mai mică de draperie chirurgicală sterilă (24 inch x 24 inch) sub stereomicroscop pentru a crea o suprafață chirurgicală. Apoi puneți o placă chirurgicală acrilică (care a fost curățată cu 70% alcool) pe suprafața drapată. Prin urmare, placa chirurgicală ar trebui să fie pe plăcuța de încălzire, dar separată de două straturi de draperii chirurgicale.
Când mouse-ul încetează să se mai miște în camera de inducție, transferați mouse-ul într-o zonă de pregătire pre-chirurgicală și poziționați-l în conul nasului conectat la vaporizator (2% izofluran). Îndepărtați părul din jurul zonei cervicale folosind un aparat de tuns electric sau o loțiune pentru îndepărtarea părului. Vă recomandăm loțiune pentru îndepărtarea părului, deoarece această metodă nu va produce bucăți de păr libere, care sunt greu de îndepărtat complet din zona chirurgicală.
Cu conul nasului în poziție, mutați mouse-ul pe placa chirurgicală.
Bandați în jos picioarele anterioare dreapta și stânga pe placa chirurgicală. Bandați ambele picioare din spate împreună pe partea dreaptă a mouse-ului. Acest lucru determină o ușoară rotație a corpului mouse-ului, astfel încât partea stângă a zonei gâtului mouse-ului devine mai bine poziționată pentru operație.
Dezinfectați zona inciziei cu 70% alcool, scrub chirurgical cu clorhexidină și din nou cu 70% alcool. Acoperiți mouse-ul cu un draperiu chirurgical sterilizat, cu excepția zonei de incizie cervicală.
Confirmați prin strângerea degetelor de la picior că șoarecele este complet anesteziat și faceți analgezie (Caprofen 3-5 mg/kg) prin injecție intraperitoneală sau subcutanată.
Sub microscopul de disecție, efectuați o incizie ventrală a liniei medii în jurul zonei cervicale utilizând fie un bisturiu, fie o foarfecă de iris. NOTĂ: Folosim foarfece deoarece distanța de lucru a stereomicroscopului este limitată, ceea ce face dificilă utilizarea unui bisturiu.
Expuneți artera carotidă comună stângă (LCCA) împingând deoparte și repoziționând glandele salivare care acoperă vasele de sânge în partea stângă a animalului.
Identificați toate vasele de sânge din câmpul chirurgical (figura 1). LCCA se bifurcă în artera carotidă internă stângă (ICA) și în artera carotidă externă stângă (ECA). Artera tiroidiană superficială (STA) apare din partea ECA pe partea medială. Artera occipitală (OA) apare de obicei din ECA, dar la unii șoareci apare din ICA.