Postul stimulează biosinteza 2-AG în rolul intestinului subțire al căilor colinergice
Nicolae V. DiPatrizio
1 Divizia de Științe Biomedice, Universitatea din California, Riverside, Școala de Medicină, Riverside, California;
2 Departamentul de Anatomie și Neurobiologie, Universitatea din California, Irvine, Școala de Medicină, Irvine, California;
Miki Igarashi
2 Departamentul de Anatomie și Neurobiologie, Universitatea din California, Irvine, Școala de Medicină, Irvine, California;
Vidya Narayanaswami
2 Departamentul de Anatomie și Neurobiologie, Universitatea din California, Irvine, Școala de Medicină, Irvine, California;
Conor Murray
2 Departamentul de Anatomie și Neurobiologie, Universitatea din California, Irvine, Școala de Medicină, Irvine, California;
Joseph Gancayco
2 Departamentul de Anatomie și Neurobiologie, Universitatea din California, Irvine, Școala de Medicină, Irvine, California;
Amy Russell
2 Departamentul de Anatomie și Neurobiologie, Universitatea din California, Irvine, Școala de Medicină, Irvine, California;
Kwang-Mook Jung
2 Departamentul de Anatomie și Neurobiologie, Universitatea din California, Irvine, Școala de Medicină, Irvine, California;
Daniele Piomelli
2 Departamentul de Anatomie și Neurobiologie, Universitatea din California, Irvine, Școala de Medicină, Irvine, California;
3 Departamentul de farmacologie, Universitatea din California, Irvine, Facultatea de Medicină, Irvine, California;
4 Departamentul de chimie biologică, Universitatea din California, Irvine, Facultatea de Medicină, Irvine, California; și
5 Descoperirea și dezvoltarea drogurilor, Institutul italian de tehnologie, Genova, Italia
Abstract
diviziunile parasimpatice și simpatice ale sistemului nervos autonom contribuie în moduri importante la reglarea echilibrului energetic (5). Studiile efectuate la șoareci au arătat că activarea receptorilor melanocortinei-4 centrale, care reduc alimentarea și sunt critice pentru menținerea metabolismului energetic (53), inhibă neuronii colangergici parasimpatici preganglionici din nucleul motor dorsal al vagului (DMV) și activează preganglionicul simpatic neuroni din măduva spinării (44). Dovezile sugerează că semnalele colinergice din nervul vag eferent controlează mecanismele de semnalizare periferice intestin-creier care reglează hrănirea. De exemplu, administrarea antagonistului atropinei de azot metilic al receptorului muscarinic al acetilcolinei restricționat periferic (mAchR) inhibă hrănirea după un post rapid (33), precum și aportul fals al unei diete lichide la șobolani (25). O posibilă interpretare a acestor rezultate este că mAchR-urile periferice participă la controlul consumului de alimente, dar mecanismele prin care s-ar putea produce o astfel de reglare rămân necunoscute.
MATERIALE ȘI METODE
Animale
Șobolani Sprague-Dawley masculi adulți (250-300 g) au fost achiziționați de la Charles River (Wilmington, MA) și adăpostiți la temperatura camerei (22 ° C) în cuști suspendate cu fund de sârmă pentru a preveni coprofagia în timpul experimentelor de privare a alimentelor. Animalele au fost întreținute într-un ciclu de lumină-întuneric de 12: 12 ore (luminile aprinse la 0630 și oprite la 1830) și au avut acces gratuit la apă și la peletele standard de rozătoare (Harlan Teklad 2020, America de Nord), cu excepția cazului în care s-a observat în timpul lipsei de hrană experimente (toate au acces gratuit la apă). Toate experimentele au început la ora 0900. Toate procedurile au respectat orientările Institutului Național de Sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din California, Irvine.
Programul chimic și administrativ
Efectele hrănitoare ale inhibării mAchR m3 intestinale și CB1R
Toate animalele (n = 10) au primit tratamente vehicul (de exemplu, soluție salină intraduodenală la 1 ml și DMSO intraperitoneal la 0,5 ml/kg cu 20 de minute înainte de realimentare după un post de 24 de ore) în prima zi de testare și în ultima zi de testare . Valorile medii pentru aporturile de realimentare de 1 oră după fiecare tratament al vehiculului, care nu au diferit statistic (25,1 ± 1,6 și 22,3 ± 1,9 g/kg corp greutate; Testul t al studentului, cu două cozi P = 0,28), au fost mediate pentru comparație statistică vs. tratamente medicamentoase. Animalele au fost apoi împărțite în două subgrupuri (n = 5/grup): subgrupul A a primit DAU5884 (100 nmol id) și AM6545 (10 mg/kg ip), iar subgrupul B a primit DAU5884 (100 nmol id) și vehiculul DMSO intraperitoneal. În următoarea zi de testare, subgrupul A a primit DAU5884 (300 nmol id) și vehiculul intraperitoneal DMSO, iar subgrupul B a primit DAU5884 (300 nmol id) și AM6545 (10 mg/kg ip). În ultima zi a tratamentelor medicamentoase, toate animalele au primit vehicul salin intraduodenal și AM6545 intraperitoneal (10 mg/kg ip).
Infuzie intraduodenală de macronutrienți
Șobolanii au fost lipsiți de alimente timp de 24 de ore și apoi au fost perfuzați cu o rată de 0,5 ml/min timp de 10 min în duoden cu vehicule (soluție salină sterilă) sau concentrații echicalorice (10 kcal total) de Intralipid, zaharoză sau Peptonă . Țesuturile au fost recoltate (vezi Prelucrarea țesuturilor) la 30 de minute după începerea perfuziilor.
Chirurgii
Catetere intraduodenale.
Vagotomie subdiafragmatică.
Toți șobolanii au fost pregătiți pentru operație, așa cum s-a subliniat mai sus (vezi cateterul intraduodenal). Stomacul și splina au fost retractate ușor, iar diviziunile dorsale și ventrale ale nervului vag de sub diafragmă au fost izolate cu forceps fin și decojite din esofag. Două suturi au fost plasate la 1,5 cm distanță pe fiecare diviziune a vagului (patru ochiuri în total) și tot țesutul neuronal dintre fiecare set de ochiuri a fost izolat și îndepărtat cu foarfece fine. Animalele care au fost supuse chirurgiei simulate de control au fost supuse acelorași proceduri descrise mai sus, cu excepția faptului că nervul vag nu a fost manipulat și a fost lăsat intact. Peretele muscular abdominal a fost închis ca mai sus (vezi cateter intraduodenal). Testarea a început după 7-10 zile de recuperare după operație.
Prelucrarea țesuturilor
Extracții lipidice.
Toate animalele au fost anesteziate cu izofluran în momentul recoltării țesuturilor și apoi jejunul sau alte organe au fost îndepărtate rapid și clătite cu PBS și congelate rapid în N2 lichid. Înainte de înghețarea rapidă, mucoasa jejunală a fost separată de seroasă prin răzuire cu o lamă de sticlă. Toate țesuturile au fost ulterior depozitate la -80 ° C până la momentul procesării. Țesuturile congelate au fost cântărite și omogenizate în 1,0 ml de metanol conținând următoarele standarde interne: [2 H8] -2-AG (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) și dinonadecadienoin (Nu-Chek Prep, Elysian, MN). Lipidele au fost extrase cu cloroform (2 vol) și spălate cu apă (1 vol). Fazele organice au fost colectate și fracționate prin cromatografie pe coloană cu silicagel în pat deschis, așa cum s-a descris anterior (3). Fracțiile eluate au fost uscate sub N2 și reconstituite în 0,1 ml cloroform: metanol (1: 3) pentru analize de cromatografie lichidă/spectrometrie de masă (LC/MS).