Pierderea funcției Aif determină moartea celulelor la embrionul șoarece, dar progresia temporală a
Contribuție de Gail R. Martin, 12 mai 2006
D. ‡ D.B. și B.D.Y. a contribuit în mod egal la această lucrare.
Abstract
Moartea celulară joacă un rol cheie atât în stările de boală, cât și în dezvoltarea normală. Unul dintre cele mai vechi evenimente din embriogeneza șoarecilor, formarea cavității proamniotice, este un proces dependent de apoptoză (1). Până în prezent, se știe puțin despre mecanismele moleculare care reglează apoptoza normală la embrionul de mamifer. Inactivarea genelor individuale din calea caspazei, care sunt considerați efectorii principali ai morții celulare, nu pare să prevină decesele celulare normale în embriogeneza timpurie (2). În schimb, s-a raportat că inactivarea Pcdc8, gena care codifică factorul inducător de apoptoză (AIF), blochează cavitația în corpii embrioni (3), un model in vitro pentru formarea de cavități proamniotice (1). Aceste date au sugerat că funcția Aif este un mediator esențial al apoptozei normale în embriogeneza timpurie a șoarecelui.
AIF a fost identificat mai întâi ca o proteină mitocondrială care poate induce modificări caracteristice apoptozei în nucleele izolate. Șoarecele și genele umane Aif sunt legate de X și codifică proteine foarte conservate, care împărtășesc o omologie semnificativă cu NADH-oxidoreductazele bacteriene. În celulele sănătoase, proteina AIF exprimată omniprezent este limitată la mitocondrii. Cu toate acestea, după tratamentul cu agenți care induc apoptoza, AIF poate fi găsit în citosol și nucleu (4). Pe baza acestor date și a altor date, s-a propus că AIF are o funcție de acceptor/donator de electroni (oxidoreductază) și o a doua funcție apoptogenă independentă (5). AIF are astfel caracteristici comune cu citocromul c, care este implicat în transferul de electroni între complexele lanțului respirator (RC) din mitocondrii și devine un efector al morții celulare după eliberarea în citosol de către stimuli apoptotici. Cu toate acestea, în timp ce se crede că citocromul c își exercită efectul apoptogen în citosol participând la activarea caspazelor călăului (6), AIF pare să-și exercite efectul apoptogen prin interacțiunea directă cu ADN (5), funcționând astfel printr-o caspază. cale independentă.
Ipoteza că AIF mediază moartea celulară la embrionul timpuriu nu a fost testată genetic până acum. Un efort inițial de a produce șoareci nul Aif prin direcționarea genelor nu a avut succes, deoarece celulele ES masculine care purtau o alelă nulă Aif pe cromozomul X unic nu au reușit să formeze șoareci himerici după injectarea în blastocisti gazdă. O explicație potențială pentru această observație este că prezența celulelor Aif -/Y ES incapabile să sufere apoptoză normală a împiedicat dezvoltarea embrionilor himerici (3). Aici, explorăm funcția Aif în embriogeneza normală utilizând Aif flox, o alelă nulă condițională Aif descrisă recent, în care exonul 7 este flancat de site-uri loxP. Prin urmare, recombinarea mediată de cre șterge nucleotidele 694 până la 778, perturbând astfel cadrul de citire (7). Datele noastre oferă dovezi că Aif nu este necesar pentru apoptoză în stadiile incipiente ale dezvoltării și, în schimb, este necesar pentru supraviețuirea celulei începând cu aproximativ ziua embrionară 9 (E9). Moartea celulară cauzată de pierderea funcției Aif a dus la un fenotip intrigant care a demonstrat că formarea modelului la șoarece poate avea loc independent de dimensiunea embrionului și numărul de celule.
Rezultate
Funcția AIF nu este necesară pentru apoptoză în corpurile embrionare sau embrionii timpurii ai șoarecilor.
Deși aceste date au lăsat deschisă posibilitatea ca capacitatea de cavitație să fie din cauza persistenței proteinei AIF materne produse în ovocit înainte de fertilizare, au sugerat cu tărie că funcția AIF nu este necesară pentru formarea cavității proamniotice în timpul embriogenezei. Pentru a explora această problemă în continuare, am căutat să determinăm dacă celulele ES derivate din blastocist AIF nule care au suferit dubluri de ≈20 pentru a dilua orice proteină AIF reziduală ar forma corpuri embrioide care au cavitat. Prin urmare, am stabilit noi linii celulare ES din descendența unei încrucișări între femelele Aif flox/flox sau Aif flox/+ și masculii β-Ac-cre Tg/Tg. Din 48 de blastocisti cultivați, am obținut 32 de linii celulare ES, dintre care 14 au purtat un cromozom Y. Jumătate din aceste linii celulare ES masculine au purtat alela AIF (nulă) recombinată și nu conțin proteine AIF (Fig. 1 B și C și datele nu sunt prezentate). Rata de proliferare celulară a fost aceeași pentru toate liniile celulare Aif nule, heterozigote și sălbatice ES în timp ce acestea au fost stabilite și menținute ulterior în cultură (datele nu sunt prezentate).
Pentru a investiga dacă AIF este necesar pentru moartea normală a celulelor într-o etapă ulterioară a embriogenezei, am examinat embrionii nul Aif la aproximativ E8,5 [8-9 stadiu somit (som)] când embrionii normali prezintă moartea celulară la joncțiunea plăcii neuronale și ectodermul de suprafață în timpul închiderii tubului neural. Embrionii AIF nulați colectați în această etapă nu aveau proteine AIF, așa cum se arată în analiza Western blot a embrionilor Aif nuli într-o etapă anterioară (0 som; Fig. 1 B și C) și nu se distinge morfologic de colegii lor de tip sălbatic. Am observat o distribuție similară a celulelor pozitive TUNEL în embrioni de tip sălbatic și Aif nul (Fig. 1 F - I), demonstrând că, în acest stadiu, moartea normală a celulelor apoptotice poate apărea în absența AIF.
Pierderea funcției AIF determină moartea celulară extinsă începând cu E9, dar modelarea embrionară este normală.
Până la E9, embrionii nul Aif s-au distins de colegii lor de tip sălbatic. Deși încă extrem de normal, dimensiunea creierului anterior și a somiților a fost ușor redusă (Fig. 2 A). Odată cu creșterea vârstei gestaționale, aceste diferențe au devenit mai pronunțate, iar embrionii nul Aif au fost semnificativ mai mici decât embrionii de tip sălbatic în același stadiu somit (Fig. 2 B - D). Până la aproximativ E11,5, puțini embrioni nul Aif examinați erau moribondi. Pentru a determina cauza diferenței de mărime, am colectat embrioni de tip somit AIF nulați și de tip sălbatic, i-am disociat și am determinat numărul total de celule pe embrion. Aif embrioni nuli la 20–21 som conțineau doar ≈1/3 la fel de multe celule ca și colegii lor de tip sălbatic. În următorii 10 soms (≈20 h), numărul total de celule din embrionii nul Aif a crescut cu doar ≈40%, comparativ cu ≈500% în colegii lor de tip sălbatic (Fig. 2 E). Inspecția vizuală a celulelor din embrioni disociați și analiza împrăștierii înainte au indicat faptul că celulele din embrionii mutanți au fost similare ca mărime (diametru) cu celulele normale (datele nu sunt prezentate). Astfel, dimensiunea redusă a embrionilor nul Aif pare a fi datorată în primul rând numărului mai mic de celule.
Numărul mediu de perechi de somite (± SD) de embrioni recoltați în diferite zile de gestație de la o cruce care produce atât embrioni nul, cât și embrioni de tip sălbatic
Pentru a determina de ce embrionii nul Aif nu au reușit să crească, am analizat încorporarea BrdU în diferite țesuturi la 20-25 som. Nu s-a detectat nicio diferență semnificativă în procentul de celule marcate între embrioni Aif nuli și embrioni de tip sălbatic (Tabelul 2), sugerând că o rată redusă de proliferare celulară nu a fost cauza principală a numărului scăzut de celule la embrioni Aif nuli. Cu toate acestea, testele pentru TUNEL la 24-25 som au arătat o moarte anormală celulară extinsă la embrioni nul Aif (Fig. 3 A și B). Aceste observații explică numărul total de celule reduse la embrioni nul Aif. Nu este clar de ce moartea anormală a celulelor nu a fost detectată la embrionii mutanți în stadiile anterioare ale somitei (de exemplu, 8-9 som; Fig. 1 H și I), chiar dacă Aif a fost inactivat în toate celulele de către stadiul cu 64 de celule și proteina AIF nu a fost detectat la 0 som (Fig. 1 C și datele nu sunt prezentate).