Pierderea de proteine ​​Smarc afectează dezvoltarea cerebelului Journal of Neuroscience

Abstract

  • AT/RT
  • creier
  • cerebel
  • dezvoltare
  • Smarc
  • tumora

Introducere

Materiale și metode

Șoareci transgenici.

Generația de șoareci care poartă un exon 1 flancat loxP al genei Smarcb1 sau o genă Smarca4 flancată loxP a fost descrisă anterior (Roberts și colab., 2002; Indra și colab., 2005). Acești șoareci au fost încrucișați la șoareci Math1-cre (Schüller și colab., 2007) pentru a genera șoareci Math1-cre: Smarcb1 fl/fl și Math1-cre: Smarca4 fl/fl. Șoarecii au fost ținuți în condiții standard. Genotiparea a fost efectuată prin PCR standard utilizând primerii specifici Cre (5'-TCCGGGCTGCCACGACCAA-3 'și 5'-GGCGCGGCAACACCATTTT-3'), primerii specifici Smarcb1 (5'-TAGGCACTGGACATAAGGGC-3 ') și 5'-GATACT și Smarca -primeri specifici (5'-GCCTTGTCTCAAACTGATAAG-3 'și 5'-GTCATACTTATGTCATAGCC-3' și 5'-GATCAGCTCATGCCCTAAGG-3 '). Șoarecii au fost monitorizați intens de două ori pe zi, inclusiv controlul greutății și mărimii.

afectează

Histologie/imunocolorare.

Țesutul încorporat în parafină a fost secționat, deparafinat și rehidratat înainte ca antigenul de recuperare indus de căldură să fie condus la 100 ° C timp de 20 min în tampon citrat de sodiu 10 m m pentru toți anticorpii. Colorarea imunohistochimică s-a făcut folosind anticorpi primari (NeuN, Smarcb1, Calbindin, Cre, fosfo-Histona H3) și sistemul de colorare HRP/DAB (DAKO) conform specificațiilor producătorului. Hemalaun a fost folosit pentru contracolorarea nucleară. Pentru dublu colorare imunofluorescentă, secțiunile au fost spălate de două ori cu PBS/0,1% Triton X-100 și apoi incubate în tampon de blocare (reactiv de blocare pe bază de proteine ​​I-Block; Applied Biosystems) timp de 30 de minute. Anticorpii primari au fost diluați în tampon de blocare și aplicați peste noapte la 4 ° C. Apoi, țesutul a fost spălat de două ori cu PBS/0,1% Triton X-100 și incubat încă 60 de minute cu o diluție de 1: 500 a anticorpilor secundari marcați cu fluorescență (capră anti-șoarece Alexa546; capră anti-iepure Alexa488, Invitrogen) tampon. Secțiunile au fost spălate de două ori cu PBS/0,1% Triton X-100, contracolorate cu 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) și montate în mediu de montare fluorescentă (DAKO). Toate imaginile secțiunilor de țesut au fost colectate pe un microscop Olympus IX50 în combinație cu sistemul de imagine moale Color View.

Cultură de celule.

Culturile precursoare ale neuronilor granulelor cerebeloase au fost generate așa cum s-a descris anterior (Lorenz și colab., 2011). Pe scurt, cerebela puilor din ziua 5 postnatală (P5) au fost scoși și preparați în HBSS (Invitrogen) cu glucoză adăugată. Meningele și țesutul plexului au fost îndepărtate cu atenție. Disocierea cerebelului colectat a fost declanșată de tripsină-EDTA-DNază. HBSS a fost înlocuit cu mediu de cultură care conține DMEM-F12 (Invitrogen), 25 m m KCl, supliment N2 (Invitrogen), penicilină-streptomicină (Pen-strep) și 10% ser fetal de vițel (FCS) (Sigma). După centrifugare, celulele au fost placate la o concentrație de 3 milioane/ml în godeuri pre-acoperite cu poli-l-ornitină (Sigma) și incubate la 37 ° C timp de 6-12 ore pentru recuperare. Apoi, mediul a fost schimbat în mediu de cultură fără ser care conține proteine ​​Shh (sisteme R&D) la o concentrație de 3 μg/ml.

Producerea virusului IRES-GFP și Cre-IRES-GFP a fost realizată așa cum a fost publicat anterior (Lorenz și colab., 2011). Pe scurt, 293 celule de ambalare (Invitrogen) au fost crescute în DMEM-10% FCS-Pen-strep-300 μg/ml G418 și transfectate cu 10 μg din fiecare construcție de virus, precum și plasmide vsv-g și gag-pol, utilizând Reactiv de transfecție Fugene 6 (Roche). Mediul care conține viruși (fără G418) a fost colectat la fiecare 24 de ore timp de 3 zile consecutive, combinat, filtrat și depozitat la -80 ° C până la utilizare.

Pentru experimentele prezentate în Figura 2, celulele au fost sortate FACS pe baza expresiei GFP folosind un FACS ARIA III (BD Bioscience). După sortarea FACS, celulele au fost replatate la o densitate de 3 milioane/ml în godeuri pre-acoperite cu poli-l-ornitină (Sigma) și incubate la 37 ° C timp de 6-12 ore pentru recuperare. Aceste celule au fost utilizate în cele din urmă pentru experimentele de numărare a celulelor [folosind camera Neubauer și contorul automat de celule TC10 (Bio-Rad)] și pentru analize de ARN.