PH-ul semenului afectează motilitatea și capacitatea spermei

Ji Zhou

1 Centru de Medicină a Reproducerii, Spitalul Jinling, Școala Clinică a Colegiului Medical, Universitatea Nanjing, Nanjing, Republica Populară Chineză,

Li Chen

1 Centru de Medicină a Reproducerii, Spitalul Jinling, Școala Clinică a Colegiului Medical, Universitatea Nanjing, Nanjing, Republica Populară Chineză,

Jie Li

2 Departamentul de Neurochirurgie, Spitalul Jinling, Școala Clinică a Colegiului Medical, Universitatea Nanjing, Nanjing, Republica Populară Chineză,

Hongjun Li

3 Departamentul de Urologie, Spitalul Colegiului Medical al Uniunii din Beijing, Academia Chineză de Științe Medicale și Colegiul Medical al Uniunii din Beijing, Beijing, Republica Populară Chineză,

Zhiwei Hong

1 Centru de Medicină a Reproducerii, Spitalul Jinling, Școala Clinică a Colegiului Medical, Universitatea Nanjing, Nanjing, Republica Populară Chineză,

Min Xie

1 Centru de Medicină a Reproducerii, Spitalul Jinling, Școala Clinică a Colegiului Medical, Universitatea Nanjing, Nanjing, Republica Populară Chineză,

Shengrong Chen

1 Centru de Medicină a Reproducerii, Spitalul Jinling, Școala Clinică a Colegiului Medical, Universitatea Nanjing, Nanjing, Republica Populară Chineză,

Bing Yao

1 Centru de Medicină a Reproducerii, Spitalul Jinling, Școala Clinică a Colegiului Medical, Universitatea Nanjing, Nanjing, Republica Populară Chineză,

Conceput și proiectat experimentele: JZ BY. A efectuat experimentele: JZ JL HJL. Analiza datelor: JZ JL HJL. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: ZWH MX SRC. Am scris lucrarea: JZ LC JL HJL BY.

Date asociate

Toate datele relevante se găsesc în lucrare.

Abstract

Introducere

Conform statisticilor raportate, aproximativ unul din șase cupluri este infertil, dintre care aproape jumătate se atribuie factorilor masculini [1]. Principalele manifestări clinice ale infertilității masculine includ reducerea numărului de spermatozoizi (oligozoospermia), scăderea motilității spermei (astenospermia) și anomaliile morfologice ale spermei (teratozoospermia) [2,3]. Peste 85% dintre bărbații infertili pot produce de fapt spermă [4], dar spermatozoizii lor sunt adesea incapabili să fertilizeze un ovul.

Unele rapoarte de cazuri clinice indică faptul că pH-ul materialului seminal al astenospermiei masculine s-ar fi modificat [11,25]. Cu toate acestea, dacă și cum pH-ul materialului seminal afectează mișcarea și capacitatea spermei rămâne neclar. Înțelegerea efectelor pH-ului plasmatic seminal poate fi utilă pentru tratamentul clinic al infertilității. Prin urmare, am investigat modificările motilității și viabilității spermei într-un interval de pH relevant din punct de vedere biologic și am măsurat activitatea Na +/K + -ATPase corespunzătoare și modificările intracelulare ale Ca 2+ ale spermatozoizilor.

Materiale și metode

Colectarea spermei

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică al Spitalului Nanjing Jinling și în conformitate cu orientările naționale și internaționale. Un total de 136 de voluntari de sex masculin au participat la acest studiu, cu o vârstă medie de 27,54 ± 3,98 (medie ± deviație standard). Înainte de inițierea studiului, a fost obținut consimțământul scris în scris de la toți participanții. Spermatozoizii supuși analizelor provin de la voluntari sănătoși de sex masculin. Acești bărbați aveau fertilitate și calitate normală a materialului seminal, conform criteriilor Organizației Mondiale a Sănătății (2010). Probele de material seminal au fost obținute prin masturbare după cel puțin 3 zile de abstinență.

Probele au fost ejaculate în recipiente sterile și lăsate să se lichefieze timp de cel puțin 30 de minute înainte de a fi procesate prin centrifugare într-un gradient Percoll de 60% (GE Healthcare, Waukesha, WI, SUA) pentru a îndepărta plasma seminală, celulele germinale imature și non-spermatozoizii. celule (în principal celule epiteliale), așa cum este descris de Loredana-Gandini și colab. [26,27]. Spermatozoizii purificați au fost apoi spălați în soluție nutrițională de spermă (NaCI 670,8 mg; KCl 35,6 mg; 147 mg/ml CaCl2 · 2H2O 171 μL; KH2PO4 16,3mg; MgSO4 · 7H2O 29,3 mg; NaHCO4 210,6 mg; D-glucoză 100 mg; 60 % Na · lactat 0,37 ml; HEPES 238 mg; Penicilină 6 mg, dizolvat în 100 ml apă sterilă) de 3 ori înainte de analiza ulterioară. Toate experimentele următoare au folosit spermă purificată grupată de la 3-4 voluntari repartizați în patru grupuri și toate experimentele au fost efectuate cel puțin în trei replici.

Evaluarea motilității spermei

Spermatozoizii purificați au fost resuspendați în soluție nutritivă de spermă cu pH 5,2, 6,2, 7,2 și 8,2 și incubați timp de 15, 30, 60, 90 și respectiv 120 de minute. Analiza semenului asistată de computer (CASA; WLJY-9000; Weili New Century Technology Development Co., Ltd.; Beijing; China) a fost utilizată pentru a evalua motilitatea spermei. Motilitate neprogresivă (NP, toate celelalte tipare de motilitate cu absența progresiei), motilitate progresivă (PR, spermatozoizii care se deplasează activ, fie liniar, fie într-un cerc mare, indiferent de viteză), motilitate (PR + NP), traiectorie medie viteza (VAP, viteza peste o cale netezită calculată), viteza curbiliniară (VCL, viteza peste pista reală a spermei, inclusiv toate abaterile de mișcare a capului spermei), viteza liniei drepte (VSL, viteza peste distanța dintre linie dreaptă între început și sfârșitul pistei spermatozoizilor) au fost calculate pentru fiecare grup din cele trei înregistrări a cel puțin 100 de spermatozoizi.

Test VOC

Testul HOS a fost utilizat în evaluarea viabilității spermei. Spermatozoizii au fost resuspendați în soluție nutrițională de spermă cu pH 5,2, 6,2, 7,2 și respectiv 8,2, timp de 60 de minute și centrifugați la 760 g timp de 15 minute. Lichidul supernatant a fost aruncat și precipitatul a fost amestecat cu 0,5 mL soluție de umflare (0,735 g citrat de sodiu dihidrat și 1,351 g D-fructoză dizolvată în 100 mL apă purificată) urmată de incubare timp de 30 min la 37 ° C. După incubare, peste 200 de spermatozoizi au fost examinați de CASA. Conform criteriilor Organizației Mondiale a Sănătății (2010), numărul de cozi de spermă umflate și, respectiv, neumflate au fost înregistrate [28].

Testul contorului de penetrare a spermei (SPM)

Capilarele pline de soluție nutritivă de spermă cu pH diferit au fost inserate perpendicular în eprubete care conțin 200 μL de lichid spermatic (spermă umană purificată în soluție nutritivă de spermă). Partea superioară a pipetelor capilare și deschiderea eprubetelor au fost sigilate cu folie de etanșare urmată de incubare timp de 1 oră la 37 ° C. Conform criteriilor Organizației Mondiale a Sănătății (2010), distanța de mișcare a spermei a fost măsurată la microscopul optic (CX31; OLYMPUS; Japonia).

Analiza Na +/K + -ATPase

Spermatozoizii (10 7) au fost diluați cu 2 ml soluții nutritive pentru spermatozoizi la pH 5,2, 6,2, 7,2 și respectiv 8,2, amestecați energic și incubați timp de 60 min la 37 ° C într-un incubator cu 5% CO2. Tuburile au fost centrifugate la 760 g timp de 15 min pentru a îndepărta soluția nutrițională, iar precipitația a fost spălată cu soluție salină normală de 3 ori și lizată prin ultrasunete (4 ° C, 40% din energie, sonicată timp de 5 s, opriți pentru 5 s, un ciclu de 1 min) (VCX750; Sonics; SUA). Concentrația de proteine a fost determinată prin testul acidului bicinchoninic (BCA) (produs nr. 23225, Thermo, SUA). Activitatea Na +/K + -ATPase a spermei a fost măsurată prin trusa de măsurare Na +/K + -ATPase (Nanjing Jiancheng Bioengineering Inc.), iar unitatea a fost demonstrată ca μmolPi/mg prot/oră.