Osteoscleroza datorată creșterii funcției Notch este exclusiv dependentă de Rbpj
Jianning Tao
1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA
Shan Chen
1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA
Tao Yang
1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA
Brian Dawson
1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA
Elda Munivez
1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Baylor College of Medicine, Houston, TX, SUA
Terry Bertin
1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Baylor College of Medicine, Houston, TX, SUA
Brendan Lee
1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA
2 Institutul Medical Howard Hughes, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA
Abstract
Introducere
Remodelarea osoasă fiziologică este un proces specificat de un echilibru între formarea osoasă de către osteoblaste și resorbția osoasă de către osteoclaste. Un dezechilibru în remodelarea oaselor contribuie la mai multe afecțiuni patologice, inclusiv osteoscleroză, osteopetroză și osteoporoză. Se estimează că aceste condiții afectează zeci de milioane de oameni. Osteoscleroza este o tulburare osoasă caracterizată printr-o îngroșare anormală și o creștere progresivă a masei osoase a scheletului datorită unui număr crescut de osteoblaste.1 În schimb, osteopetroza rezultă dintr-o scădere primară a funcției osteoclastice.2 În prezent, factorii cauzali extrinseci (de exemplu, fluoroză) care sunt asociate cu osteoscleroza.3, 4, 5, 6 Cu toate acestea, rapoartele despre factorii genetici cauzali sau căile de semnalizare care sunt implicate în osteoscleroză au fost limitate.7, 8, 9, 10
De la debutul acestui deceniu până în prezent, studiile genetice umane au identificat mutații în multe componente ale căii de semnalizare Notch care cauzează defecte scheletice.14 De exemplu, mutațiile genei DLL3 și ulterior ale genelor MESP2 și LFNG au fost identificate ca cauzând disostoză spondilocostală (SCDO), o tulburare moștenită caracterizată prin formare și modelare vertebrală anormală. În același timp, studiile modelelor de șoarece mutante corespunzătoare ne-au mărit înțelegerea acestor defecte congenitale.15 În plus, semnalizarea aberantă Notch joacă un rol important în patogeneza leucemiei și a altor tipuri de cancer.16 Studiile intensive au identificat noi mutații de activare în Receptorul Notch1 care este responsabil pentru mai mult de 50% din eșantioanele de leucemie limfoblastică acută cu celule T umane (T-ALL). 20
Materiale și metode
Animale
Șoareci knockout condiționati Rbpj flox/flox, șoareci transgenici Col1a1 2.3 - kb Cre (TG Col1a12.3kbCre/+) și șoareci transgenici Rosa Notch (TG NICDflox/+) au fost descriși anterior.25, 26, 27 Acești șoareci au fost menținuți pe un fundal hibrid 129 × C57BL/6. Genotiparea PCR a fost efectuată așa cum a fost descris. Animalele au fost utilizate în conformitate cu Ghidul Institutelor Naționale de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator. Toți șoarecii au fost adăpostiți într-o instalație specifică fără patogeni și în condiții controlate de lumină, temperatură și umiditate. Aceste studii au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Baylor College of Medicine.
Pregătirea scheletului și histologia
Preparatele scheletice montate în întregime colorate cu albastru alcian 8GX (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și roșu alizarină S (Sigma Aldrich) au fost preparate așa cum s-a descris anterior.21 Littermates of control, GOF mutant sau GOF: Rbpj f/șoarecii au fost eutanasiați la vârsta de 3 până la 8 săptămâni, iar scheletele întregi au fost fixate în formalină tamponată neutră 10% peste noapte. Am secționat oase decalcificate încorporate în parafină la o grosime de 6 - µm și am colorat secțiunea cu hematoxilină și eozină (H&E), albastru de toluidină și pete Goldner folosind protocoale standard. Preparatele scheletice ale membrelor au fost fotografiate cu o cameră digitală Nikon de 5,0 megapixeli montată deasupra unei lunete de disecție Nikon SMZ1500. Toate setările microscopului și ale camerei au fost identice pentru captarea tuturor imaginilor. Fișierele de imagine digitale au fost încărcate într-un software Axiovision (Carl Zeiss Vision, Munchen - Hallbergmoos, Germania) conectat la un scop Zeiss Axioplan 2, iar echivalența scării a fost realizată prin transferul informațiilor de calibrare a micrometrului de etapă. Aceste proceduri au permis compararea directă a fiecărei imagini.
Măsurători de tomografie micro-computerizată osoasă (µCT)
Am analizat osul trabecular al femurului distal printr-un sistem µCT (µCT - 40, Scanco Medical, Basserdorf, Elveția) folosind un protocol standard din nucleul µCT de la Colegiul de Medicină Baylor. Pe scurt, femurele de la șoareci de 8 săptămâni au fost disecate, curățate de țesut moale și fixate 2 zile în formalină tamponată 10% neutră și apoi depozitate în 70% etanol la 4 ° C. Osul trabecular a fost analizat la capătul distal al femurului începând de la capătul plăcii de creștere. Șaptezeci și cinci de felii care acoperă o lungime totală de 1,20 mm au fost evaluate în spongioza secundară la rezoluție înaltă. O valoare prag de 210 a fost utilizată pentru evaluarea 3D.