O analiză moleculară a diversității dietetice pentru trei nativi americani arhaici PNAS

Comunicat de Patty Jo Watson, Washington University, St. Louis, MO (primit pentru recenzie 22 iunie 2000)

dietetice

Abstract

ADN-ul a fost extras din trei probe fecale, vechi de peste 2.000 de ani, din Hinds Cave, Texas. Amplificarea secvențelor ADNmt umane a arătat apartenența lor la nativii americani contemporani, în timp ce secvențele de la antilopa pronghorn, oile bighorn și iepurele cu coadă coton au permis identificarea acestor animale ca parte a dietei acestor indivizi. Mai mult, amplificarea secvențelor de ADN de cloroplast a identificat opt ​​plante diferite ca elemente dietetice. Acești oameni arhaici au consumat 2-4 specii de animale diferite și 4-8 specii de plante diferite într-o perioadă scurtă de timp. Rata de succes pentru recuperarea ADN-ului din paleofeces este în contrast puternic cu cea din rămășițele scheletice unde rata de succes este în general scăzută. Astfel, rămășițele paleofecale umane reprezintă o sursă de ADN antic care se completează semnificativ și poate fi, în unele cazuri, superioară celei din țesutul scheletic.

ADN-ul recuperat din excrementele lăsate până acum la animale dispărute permite identificarea și studiul genetic al acestora și dezvăluie aspecte ale dietei lor (1). În timpul săpăturilor arheologice se găsesc, de asemenea, cantități mari de materiale fecale antice de origine umană presupusă, în special în peșteri uscate și adăposturi de roci. Un astfel de sit este Peștera Hinds, situată la marginea estică a deșertului Chihuahuan din sud-vestul Texasului, unde au fost găsite peste 1.000 de depozite fecale umane supuse în timpul unei săpături din 1974 (2).

Pentru a investiga dacă un astfel de material poate fi folosit pentru a studia secvențele ADN de la oamenii antici și din alimentele pe care le-au ingerat, am analizat compoziția moleculară și conservarea ADN pentru trei probe paleofecale (numerotate I-III aici) (Fig. 1). Rezultatele arată că secvențele ADN de la indivizii defecați, precum și cele de la plante și animale consumate de aceștia pot fi recuperate. Analizele acestor secvențe permit determinarea afilierilor populației mtDNA ale oamenilor și oferă, de asemenea, informații despre dietele lor.

Paleofeces umane din Hinds Cave, Texas. [Scară, 1 cm în fotografie este egal cu 2,78 cm real (diapozitiv).]

Materiale și metode

Proceduri experimentale.

Pentru a evalua nivelul de conservare biomoleculară înainte de analiza ADN, am analizat probele prin piroliză cromatografie gazoasă/MS, așa cum sa efectuat pe probele de coprolit anterioare (1). Aproximativ 15 mg de probe paleofecale măcinate au fost pirolizate și analizate prin piroliză-cromatografie gazoasă/MS) așa cum este descris pentru probele osoase (3).

ADN-ul a fost extras o dată din toate probele așa cum este descris (1). În plus, a fost efectuată câte o extracție din probele I și II cu următoarele modificări. Două până la trei grame de materie paleofecală uscată au fost rehidratate timp de 5 zile în întuneric într-un desicator de sticlă conținând o sticlă deschisă de 500 ml de apă dublă distilată, care a fost lăsată să se evapore ajutată de o bandă de hârtie de filtru Whatman cu un capăt în apa și un capăt pe exteriorul sticlei. Umiditatea relativă din desicator a atins un platou de 92% în a doua zi. După rehidratare, probele au fost plasate în tuburi Falcon de 50 ml conținând 10 ml tampon de extracție clorură de litiu (0,1 M Tris⋅Cl, pH 7,2/10 mM EDTA, pH 8,0/0,5 M LiCl/1% litiu dodecil sulfat/50 mM DTT/200 μg/ml Proteinaza K), care a fost rotită peste noapte la 37 ° C. S-au adăugat cinci mililitri de bromură de cetiltrimetilamoniu 4%, 2% polivinilpirolidonă și s-au rotit din nou peste noapte la 37 ° C. Din acest amestec, 1 ml a fost extras așa cum este descris (1) în timp ce restul a fost înghețat la -20 ° C pentru extracție ulterioară. Extracția suplimentară de ADN a probei III pentru replicare independentă a fost efectuată la Oxford așa cum este descris (1).

Amplificările PCR au fost efectuate așa cum este descris (4) utilizând primerii enumerați mai jos pentru trei site-uri de restricție (HaeIII, HincII și AluI), repetarea de 9 bp, regiunea hipervariabilă I, genele 12S și 16S rRNA și gena clorplast rbcL: L00635 5'-TGAAAATGTTTAGACGGCCTCACATC-3 '; H00708, 5'-TAGAGGGTGAACTCACTGGAAC-3 '; L13259, 5'-AATCGTAGCCTTCTCCACTTCA-3 '; H13377, 5'-TATCTTGTTCATTGTTAACGTTGTGG-3 '; L05054, 5'-TAGGATGAATAATAGCAGCTCTACCG-3 '; H05184, 5'-GGGTGGATGGAATTAAGGGTGT-3 '; L09158, 5'-ATACTACGGTCAATGCTCTG-3 '; H09297, 5'-ATGCTAAGTTAGCTTTACAG-3 '; L16131, 5'-CACCATGAATATTGTACGGT-3 '; H16218, 5'-ATGTGTGATAGTTGAGGGTTG-3 '; L16209, 5'-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3 '; H16303, 5'-TGGCTTTATGTACTATGTAC-3 '; L16287, 5'-CACTAGGATACCAACAAACC-3 '; H16379, 5'-CAAGGGACCCCTATCTGAG-3 '; 12Sa ′, 5′-CTGGGATTAGATACCCCACTAT-3 ′; 12Deci, 5′-GTCGATTATAGGACAGGTTCCTCTA-3 ′; 16S6, 5'-TTTCGGTTGGGGCGACCTCGGAG-3 '; 16S7, 5'-TTGCGCTGTTATCCCTAGGGTAACT-3 '; rbcLZ1, 5′ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCAAGT-3 ′; rbcL19b, 5′CTTCTTCAGGTGGAACTCCAG-3 ′ și rbcL19, 5′-AGATTCCGCAGCCACTGCAGCCCCTGCTTC-3 ′.

Amplificări ale porțiunilor din regiunea hipervariabilă au fost efectuate de două ori pentru toate probele pentru a detecta substituții din cauza încorporărilor greșite de nucleotide care pot fi prezente în toate clonele atunci când amplificările care încep de la câteva sau de la molecule cu șablon unic (5). Toate produsele de amplificare au fost clonate în vectori de clonare TA (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului, așa cum este descris (5). PCR de colonie a fost efectuat așa cum este descris (6). Secvențierea a fost efectuată cu un kit de secvențiere a ciclului (Amersham Pharmacia) conform instrucțiunilor producătorului.

Identificarea plantelor.

Un total de 111 clone rbcL au fost secvențiate. Deoarece diferențele de nucleotide prezente într-o singură clonă sunt susceptibile de a fi rezultatul încorporării greșite a nucleotidelor în timpul PCR, secvențele consensuale ale fiecărui grup de secvențe înrudite au fost luate pentru a reprezenta secvența unei anumite plante prezente în specimenul paleofecal. Aceste secvențe au fost identificate taxonomic așa cum este descris (1) prin utilizarea programului blastn (20 ianuarie 2000). Au fost observate familii și comenzi care se potrivesc cu 0 și/sau 1 nepotrivire. În cazul în care o singură familie se potrivește cu secvența, se presupune că acea familie este corectă, în cazul în care două sau mai multe familii din aceeași ordine se potrivesc, ordinea a fost considerată ordinea corectă. Cinci clone care nu au putut fi asociate cu niciun cluster de secvențe și intrări de baze de date potrivite la mai mult de două diferențe au fost considerate neidentificabile. În cele din urmă, două clone identice din eșantionul II (vezi Fig. 3, indicat prin *) au prezentat o diferență la două familii din ordinul Zingiberales. Membrii acestui ordin nu sunt nici aridați, nici adaptați la climele continentale, prin urmare, cea mai simplă explicație pentru această constatare este o identificare greșită, probabil deoarece niciun reprezentant al familiei corecte nu este prezent în baza de date.

Identificarea animalelor.

Pentru a identifica secvențe de vertebrate neumane în ampliconii ADN-ului care codifică ARNr 12S și 16S, am clonat produsele PCR și am examinat clonele printr-o PCR de colonie folosind primerii M13 înainte și invers cu adăugarea unui al treilea exemplu specific uman. (12SA′H 5′-GCCCTAAACCTCAACAGTTAAATC-3 ′ și respectiv 16S6H 5′-ACCAGTCAAAGCGAACTACTATAC-3 ′, respectiv). Toate produsele PCR care prezintă un produs de amplificare de lungimea așteptată pentru o inserție relevantă, dar nereușind să prezinte produsul de amplificare uman mai scurt au fost secvențiate. Screeningul a 68 de clone 12D rADN din proba I a dus la trei clone neumane; întrucât nu s-au găsit clone neumane în 64 de clone 12D rADN din eșantionul II și nici între 33 și 28 de clone 16S rADN din eșantioane I și, respectiv, II. Secvențele au fost comparate cu secvențele GenBank utilizând blastn (20 ianuarie 2000). Familiile care se potrivesc la 0 și 1 nepotriviri au fost notate împreună cu următorul meci cel mai apropiat, iar identificările au fost făcute atunci când o singură (și o singură) familie s-a potrivit la 0 și 1 nepotrivire.