NaCl dietetic reglează relevanța aminopeptidazei renale N pentru hipertensiunea arterială la șobolanul Dahl

De la Secția de Cardiologie (M.F., T.L.W., B.P.R., D.L.G., R.S.D.), Departamentul de Medicină, Universitatea din Illinois din Chicago și West Side Division Veterans Administration (M.F., B.P.R., R.S.D.), Chicago Health Care System, Chicago, Ill.

Vizualizați cea mai recentă versiune a acestui articol. Versiunile anterioare:

Abstract

Aminopeptidaza N (APN) este o metallohidrolază abundentă la marginea pensulei a celulelor tubulare proximale ale rinichilor care degradează angiotensina III (Ang III) la angiotensină IV (Ang IV) și, împreună cu dipeptidilaminopeptidaza, degradează Ang IV. Am examinat impactul unei diete bogate în sare asupra activității APN renale și a abundenței de transcrieri la tulpinile de șobolan Sprague-Dawley și Dahl sensibile la sare (SS/Jr). Abundența transcrierii APN și abundența de proteine au fost de aproximativ 2 ori mai mari ( 1 Ang III împarte multe dintre funcțiile fiziologice ale Ang II în sistemul cardiovascular și nervos, inclusiv stimularea secreției de vasopresină, aldosteron și catecolamină. 1 Similar cu Ang II, acționează ca un agent pro-inflamator prin stimularea producției de citokine MCP-1 și activarea NF-kB și AP-1. Ang III a fost postulat pentru a contribui la răspunsul inflamator și la creșterea celulelor cu progresia bolii renale. 2,3 Cu toate acestea, se crede că Ang IV are activitate biologică minoră, deoarece receptorii Ang II AT1 și AT2 au o afinitate slabă pentru Ang IV, iar perfuzia Ang IV nu provoacă efecte dependente de Ang II. 4.5 Recent, receptorii pentru Ang IV au fost detectați în canalele colectoare corticale și celulele mezangiale 6 și Ang IV, spre deosebire de Ang III, sa dovedit a crește fluxul sanguin renal și vasodilatația cerebrală. 7 Astfel, APN poate fi într-o poziție critică pentru a modula absorbția de sare în nefroni și rezistența vasculară renală prin controlul metabolismului Ang III până la Ang IV. Am emis ipoteza că APN poate juca un rol mecanic în adaptarea la sare și hipertensiune.

APN este un constituent major al membranelor de la marginea periei a celulelor tubulare proximale ale rinichilor și a enterocitelor. 8,9 APN (nomenclatura enzimatică IUBMB ec 3.4.11.2, ap-n), cunoscută și sub denumirea de aminopeptidază microsomală sau aminopeptidază M, este o aminopeptidază homodimerică, legată de membrană, peptidază dependentă de zinc, care eliberează preferențial aminoacizi neutri din capătul N-terminal al oligopeptidelor și are specificitate similară cu cea a leucinei aminopeptidazei citosolice. 10.11. APN aparține familiei M1 a clanului MA al peptidazelor, care include glicoproteine de tip II legate de membrană și a fost clonată din 6 specii de mamifere diferite. În studiul de față, am examinat impactul conținutului de sare din dietă asupra APN renal la șobolanii normotensivi și Dahl sensibili la sare (SS).

Metode

Animale

Protocoalele de utilizare a animalelor au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor pentru administrarea veteranilor din Chicago-West Side. Șobolanilor masculi Sprague-Dawley, Lewis și Dahl SS/Jr cu o greutate cuprinsă între 250 și 300 de grame și obținuți de la Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, Ind) li s-au administrat diete bazice (0,3%) și cu conținut ridicat de sare (8%) Purina seria 5500) timp de 10 zile. Sodiul urinar a fost măsurat pentru a confirma dietele. Măsurătorile intra-aortice ale tensiunii arteriale au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. Au fost raportate anterior măsurători telemetrice ale tensiunii arteriale ale acestor sosiri. 12

Prepararea ARN-ului

Rinichii au fost îndepărtați și congelați rapid în azot lichid. ARN-ul total a fost izolat cu TRIzol (Invitrogen), cu îndepărtarea ulterioară a contaminanților reziduali utilizând trusa de izolare a ARN-ului total RNeasy (Qiagen). Pentru ARNm poli (A) + de înaltă calitate, ARN-ul total preparat de TRIzol a fost urmat de utilizarea kitului de ARNm Oligotex (Qiagen).

Reacție în lanț în timp real a polimerazei

Amplificările cu reacție în lanț de polimerază verde SYBR (PCR) au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. 12 grunduri APN au fost proiectate pe baza numărului de acces la baza de date GenBank AFO39890 (gena Rattus norvegicus APN, exonul 2 și CD-uri parțiale) folosind Primer Express Software versiunea 1.0 (PE Applied Biosystems) și verificate prin rularea PCR virtuală (înainte: 5 ′ TCCTGGAGCCTGGTGAATCC 3 ′; invers: 5, GGAAAGGCGGTGACACTAAT 3 ′). Grundele pentru GAPDH au fost după cum urmează: înainte = 5 ′ GAAGGGCTCATGACCACAGT 3 ′; invers = 5 ′ GGATGCAGGGATGATGTTCT 3 ′. PCR a produs benzi unice de dimensiunile prevăzute. Secvențierea acestor produse clonate a verificat specificitatea genei. Near-log - a fost observată amplificarea liniară, amplificarea având loc între ciclurile 26 și 32. Fiecare probă și reacție au fost reproduse de 3 ori. Expresia a fost normalizată la GAPDH ca referință endogenă și relativă la expresia genei de sare bazală ca calibrator.

Analiza occidentală

Analiza imunoblot a omogenatului de rinichi a fost efectuată așa cum s-a descris anterior. 12 membrane au fost imunoprobate cu anticorp APN policlonal antiuman uman (CD13 Ab-3 Laboratory Vision). Anticorpul secundar a fost un anticorp conjugat anti-șoareci de capră IgG HRP (Santa Cruz Biotechnology). Bloturile au fost controlate pentru diferențele de încărcare a probei prin normalizare la actină.