Mislocalizarea pe scară largă a FUS este un semn distinctiv molecular al sclerozei laterale amiotrofice
Giulia E Tyzack
1 Institutul Francis Crick, 1 Midland Road, Londra, Marea Britanie
2 Departamentul de boli neuromusculare, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londra, Marea Britanie
Raphaelle Luisier
1 Institutul Francis Crick, 1 Midland Road, Londra, Marea Britanie
Doaa M Taha
1 Institutul Francis Crick, 1 Midland Road, Londra, Marea Britanie
2 Departamentul de boli neuromusculare, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londra, Marea Britanie
Jacob Neeves
1 Institutul Francis Crick, 1 Midland Road, Londra, Marea Britanie
2 Departamentul de Boli Neuromusculare, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londra, Marea Britanie
Miha Modic
1 Institutul Francis Crick, 1 Midland Road, Londra, Marea Britanie
2 Departamentul de boli neuromusculare, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londra, Marea Britanie
Jamie S Mitchell
1 Institutul Francis Crick, 1 Midland Road, Londra, Marea Britanie
2 Departamentul de Boli Neuromusculare, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londra, Marea Britanie
Ione Meyer
2 Departamentul de boli neuromusculare, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londra, Marea Britanie
Linda Greensmith
2 Departamentul de boli neuromusculare, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londra, Marea Britanie
Jia Newcombe
3 NeuroResource, Departamentul de Neuroinflamare, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londra, Marea Britanie
Jernej Ule
1 Institutul Francis Crick, 1 Midland Road, Londra, Marea Britanie
2 Departamentul de boli neuromusculare, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londra, Marea Britanie
Nicholas M Luscombe
1 Institutul Francis Crick, 1 Midland Road, Londra, Marea Britanie
4 UCL Genetics Institute, University College London, Gower Street, Londra, Marea Britanie
5 Institutul Okinawa de Știință și Tehnologie Universitatea Absolventă, Okinawa 904-0495, Japonia
Rickie Patani
1 Institutul Francis Crick, 1 Midland Road, Londra, Marea Britanie
2 Departamentul de boli neuromusculare, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londra, Marea Britanie
Date asociate
Datele care susțin rezultatele acestui studiu sunt disponibile de la autorul relevant, la cerere rezonabilă.
Abstract
A se vedea Vidal și Atkin (doi: 10.1093/brain/awz256) pentru un comentariu științific la acest articol.
Introducere
Scleroza laterală amiotrofică (SLA) este o afecțiune neurodegenerativă progresivă neîncetat, care rămâne incurabilă datorită înțelegerii noastre incomplete a patogenezei moleculare. Descoperirile genetice din SLA implică puternic regulatori de prelucrare a ARN-ului exprimate omniprezent (Taylor și colab., 2016). Din punct de vedere patologic, în 97% din cazuri, proteina TDP-43 este localizată greșit de la nucleu la citoplasmă, unde se agregă (Neumann și colab., 2006). Cu toate acestea, mutațiile cauzatoare de SLA în fuziunea în sarcom (FUS) și superoxid dismutaza 1 (SOD1) lipsesc în mod vizibil proteinopatie TDP-43 în majoritatea cazurilor (Mackenzie și colab., 2007). Agregarea FUS este o caracteristică recunoscută a SLA legată de mutația FUS (Vance și colab., 2009). Cu toate acestea, conceptul conform căruia mislocalizarea nucleară către citoplasmatică FUS de tip sălbatic (mai degrabă decât agregarea) ar putea fi o caracteristică mai răspândită a altor forme de SLA nu a fost evaluată în mod sistematic la cunoștința noastră. Într-adevăr, o astfel de localizare greșită poate să fi evitat detectarea până acum datorită tendinței spre studierea agregatelor/incluziunilor, mai degrabă decât localizării subcelulare perturbate a proteinelor neagregate singure. Această posibilitate este întărită de faptele care (i) afectează compartimentarea nuclearo-citoplasmatică fiind din ce în ce mai recunoscută ca o caracteristică cheie a SLA (Boeynaems et al., 2016); și (ii) FUS este cunoscut pentru a naveta între nucleu și citoplasmă.
Aici am investigat sistematic localizarea proteinei FUS pe un model de celule stem pluripotente induse de om (iPSC), modele transgenice de șoarece și țesut uman post-mortem din mai multe cazuri de SLA sporadică. Găsim că mislocalizarea nucleară-citoplasmatică a FUS este o caracteristică mai răspândită a SLA decât s-a recunoscut anterior. Mai mult, prezentăm dovezi care susțin un mecanism molecular presupus pentru această mislocalizare prin interacțiunea dintre proteina FUS și transcrierea SFPQ aberantă care păstrează intronul.
Materiale și metode
Cultură de celule stem pluripotente induse și diferențierea neuronilor motori
IPSC-urile au fost menținute folosind protocoale standard. Diferențierea neuronilor motori a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Hall și colab., 2017; Luisier și colab., 2018). Consultați Material suplimentar pentru informații mai detaliate. Detaliile liniilor iPSC sunt furnizate în Tabelul 1 suplimentar.
Animale, modele transgenice și prelucrarea țesuturilor
Țesut uman post-mortem
Secțiunile de țesut înghețat rapid au fost obținute de la măduva spinării lombare a opt donatori sănătoși și a pacienților SLA sporadici cu vârsta și sexul de 12 ani (tabelul suplimentar 2). Timpul de întârziere până la înghețarea rapidă a fost, de asemenea, comparabil între grupuri [întârziere medie ± deviație standard (SD): 30,13 ± 12,87 și 27,75 ± 10,63 h, pentru pacienții martor și respectiv SLA sporadici]. Probele măduvei spinării au fost obținute de la banca de țesuturi NeuroResource, UCL Institute of Neurology, Londra, Marea Britanie. Probele au fost donate băncii de țesuturi cu consimțământul scris al donatorului de țesuturi, în urma examinării etice a Comitetului NHS NRES Londra - Central și stocate sub o licență sectorială de cercetare de la Autoritatea pentru țesuturi umane (HTA) din Marea Britanie. În acest studiu, cazurile de SLA au fost considerate sporadice de absența oricărui istoric familial de boală a neuronilor motori. Mai mult, toate cazurile au arătat patologia TDP-43 atunci când au fost examinate de NeuroResource, sugerând că nu sunt mutanți SOD1 [deoarece patologia TDP-43 este absentă în cazurile de SLA legate de SOD1 (Mackenzie și colab., 2007)].
Imunomarcare, imagistică și analiză a imaginii
Fracționarea celulelor, extracția ARN, transcrierea inversă și PCR cantitativă
Hibridizare in situ a fluorescenței cu o singură moleculă
Sondele au fost proiectate folosind software-ul Probe Designer de la Biosearch Technologies și au fost furnizate de același furnizor. Probele incluse au fost concepute împotriva intronului SFPQ conjugat cu Quasar®570 (SMF-2037-1) și SFPQ matur conjugat cu Quasar®670 (secvențe de probe disponibile la cerere). Cuantificarea semnalului de hibridizare a fost efectuată utilizând algoritmul personalizat de detectare a intensității spotului în celulele segmentate DAPI pentru a separa semnalul nuclear și citoplasmatic.