MiR-182-5p îmbunătățește viabilitatea, mitoza, migrația și capacitatea de invazie a cancerului gastric uman

Yuling Li

1 Departamentul de Fiziopatologie, Universitatea de Medicină Binzhou, Yantai 264003, Shandong, China

Shudong Chen

2 Departamentul de Chirurgie Gastro-intestinală Secția II, Spitalul Yantai Yuhuangding afiliat al Universității Qingdao, Yantai 264000, Shandong, China

Zhengfei Shan

3 Departamentul de Urologie, Spitalul Yantai Yuhuangding afiliat al Universității Qingdao, Yantai 264000, Shandong, China

Liyan Bi

4 Departamentul de Otologie Transformativă și Centrul de Neuroștiințe, Universitatea de Medicină Binzhou, Yantai 264003, Shandong, China

Shengqiang Yu

3 Departamentul de Urologie, Spitalul Yantai Yuhuangding afiliat al Universității Qingdao, Yantai 264000, Shandong, China

Yongwei Li

3 Departamentul de Urologie, Spitalul Yantai Yuhuangding afiliat al Universității Qingdao, Yantai 264000, Shandong, China

Sen Xu

5 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Universitatea de Medicină Binzhou, Yantai 264003, Shandong, China

Abstract

Introducere

Cancerul gastric (GC) este una dintre cele mai frecvente tumori maligne ale sistemului digestiv, are aproximativ 951.600 de cazuri noi și provoacă 723.100 de decese în fiecare an [1]. Deși a existat o scădere constantă a incidenței și mortalității GC în țările dezvoltate, în zonele mai puțin dezvoltate, aceasta are încă un al treilea nivel amenințător atât în incidența cancerului, cât și în mortalitate [1]. Cauzele GC sunt complexe și pot include factori precum o dietă dezechilibrată, fumatul, alcoolul și infecția cu Helicobacter pylori [2]. Mai mult, patogenia GC este, de asemenea, raportată la factori genetici precum metilarea ADN-ului, inactivarea epigenetică a mai multor gene, amplificări și deleții genetice și mutații somatice aberante [2].

Absența simptomelor clinice specifice pune obstacole în diagnosticul precoce al GC [3]. Prin urmare, pacienții cu GC sunt întotdeauna diagnosticați în stadii avansate care duc la metastaze grave și prognostic slab. Rata de supraviețuire la 5 ani este mai mică de 30% [4-6]. Chirurgia a fost opțiunea principală de tratament pentru GC în ultimele decenii, cu un tratament auxiliar de chimioradiere și chimioterapie [7,8]. Terapia medicamentoasă pe bază de gene este o abordare potențială pentru tratamentul GC [9]. Cu toate acestea, din cauza lipsei de înțelegere a mecanismelor moleculare din spatele dezvoltării GC, în prezent nu există o terapie eficientă pentru GC [10].

Datele din baza de date TargetScan sugerează că există o relație de direcționare între miR-182-5p și RAB27A. Am făcut presupunerea că miR-182-5p reglează activitatea în celulele GC vizând RAB27A și am efectuat o serie de experimente pentru a testa această ipoteză. Am investigat rolul miR-182-5p și am evaluat mecanismul său de reglare în tumorigeneză gastrică și progresii.

Materiale și metode

Țesuturile umane

Treizeci de GC umane și țesuturile para-carcinomului (distanța de carcinomul gastric a fost de 2 cm) au fost obținute de la Spitalul Afiliat Yantai Yuhuangding din Universitatea Qingdao în perioada 20 martie 2015 - 20 mai 2016. Probele au fost ulterior congelate în azot lichid pentru continuarea studiilor. Țesuturile para-carcinomului au fost identificate de trei medici din spital și s-au confirmat că sunt libere de cancer. Toți pacienții și-au dat consimțământul în cunoștință de cauză și aprobarea etică a fost obținută de la Comitetul de Etică Umană al Spitalului Afiliat Yantai Yuhuangding al Universității Qingdao.

Cultură de celule

Liniile celulare de cancer gastric uman (HGC) și liniile celulare gastrice normale umane care cuprind HGC-27, MKN-45, SGC-7901 și MGC-803 au fost cumpărate de la banca de celule a Academiei de Științe din China (Shanghai, China) și cultivate la Roswell Park Memorial Institute (RPMI, New York, SUA) -1640 cu 10% ser fetal bovin (FBS) într-o atmosferă umidificată de 37 ° C și 5% CO2.

Extracția ARN și PCR cantitativă în timp real

ARN-ul total al țesuturilor și celulelor a fost extras folosind reactivul TRIzol conform instrucțiunilor producătorului. ARN-urile totale (5 μg) și miARN-urile (5 μg) au fost apoi transcrise invers în ADN-uri complementare (ADNc). Amestecul SYBR Green PCR a fost utilizat pentru analiza cantitativă în analiza cantitativă în timp real PCR (qRT-PCR). Primerii pentru miR-182-5p, RAB27A și alte gene au fost achiziționați de la RiboBio Co., Guangzhou, China (Tabelul 1). Vectorii PCMV-Sport6 (Invitrogen, Carlsbad, CA, S.U.A.) au fost folosiți pentru recombinarea ADNc-urilor RAB27A, iar tehnica de secvențiere a ADN-ului (contractată cu Sangon Biotech, Shanghai, China) a fost utilizată pentru a confirma recombinarea cu succes. U6 (RNU6B) și GAPDH au fost utilizate ca standarde interne de normalizare pentru mRNA miR-182-5p și respectiv RAB27A. Statisticile au fost analizate folosind metoda 2 - Δ Δ C t.