MicroARN-17-5p agravează leziunile induse de lipopolizaharide în celulele epiteliale nazale prin țintire
Abstract
fundal
La nivel global, rinita este una dintre cele mai frecvente tulburări cronice. În ciuda disponibilității medicamentelor pentru gestionarea simptomatologiei rinitei, cercetătorii încă se concentrează pe identificarea unor ținte moleculare noi pentru o mai bună gestionare. MicroARN-urile sunt implicate în multe procese biologice și patologice. Cu toate acestea, rolul miR-17-5p în rinită rămâne neexplorat. Acest studiu a avut ca scop explorarea rolului miR-17-5p în leziunea indusă de lipopolizaharidă (LPS) a celulelor epiteliale nazale RPMI2650 și elucidarea posibilului mecanism molecular de bază.
Rezultate
LPS a deteriorat celulele RPMI2650 prin inhibarea proliferării celulare, promovarea apoptozei și stimularea eliberării citokinelor inflamatorii. Expresia miR-17-5p a fost semnificativ crescută în celulele RPMI2650 după tratamentul cu LPS. Mai mult, s-a constatat că supraexprimarea miR-17-5p a dus la agravarea leziunilor induse de LPS. miR-17-5p expresie reglată negativ a Smad7; supraexprimarea Smad7 a protejat celulele RPMI2650 prin inactivarea căilor de catenină NF-κB și Wnt/β și invers.
Concluzii
Supraexprimarea miR-17-5p a deteriorat celulele RPMI2650 induse de LPS. Exprimarea Smad7 a fost reglementată negativ de miR-17-5p; Expresia Smad7 a inactivat căile de catenină NF-κB și Wnt/β.
fundal
Rinita este una dintre cele mai frecvente afecțiuni inflamatorii ale căilor respiratorii superioare [1]. Această afecțiune este declanșată de expunerea celulelor mucoasei nazale la alergeni. Statisticile actuale sugerează că aproximativ 15% dintre adolescenți suferă de rinită alergică la nivel mondial [1, 2]. Pe lângă obstrucția nazală, senzația de mâncărime și strănutul frecvent, rinita este, de asemenea, una dintre cauzele importante ale somnului tulburat [1]. Această afecțiune este dificil de diagnosticat la copiii mici [3]. Identificarea posibililor factori de mutagenitate genetică și de mediu, elucidarea căilor moleculare implicate în patogeneza rinitei, identificarea unor ținte medicamentoase noi și îmbunătățirea strategiilor actuale de tratament, rămân obiectivul principal în cercetarea rinitei [1,2,3].
MicroARN-urile (miARN-urile sau miR-urile) aparțin familiei ARN-urilor necodificate, așa cum sugerează și numele lor, au dimensiuni mai mici, formate din 22-25 de nucleotide. miARN-urile se leagă de 3’-UTR (regiunea netradusă) a mARN-ului lor corespunzător și provoacă inhibarea post-translațională a acestor mARN-uri [4]. Se știe că miARN-urile sunt exprimate pe scară largă în corpul uman și modulează diverse procese fiziologice și patologice, cum ar fi dezvoltarea de organe, proliferarea celulară, diferențierea celulară, tumorigeneză și apoptoză [5]. Studiile au stabilit deja rolul mai multor miARN în rinită, inclusiv miR-21, miR-30-5p, miR-199b-3p, miR-874, miR-28-3p, miR-203, miR-875-5p etc. . [6,7,8]. Unele dintre miARN-urile menționate mai sus sunt exprimate ridicat, în timp ce altele sunt exprimate scăzut [6,7,8].
Mai multe studii au explorat rolul miR-17-5p în diferite tipuri de cancer [9,10,11,12]. De exemplu, miR-17-5p a mediat autofagia indusă de hipoxie și a inhibat apoptoza în celulele musculare netede vasculare [13]. Creșterea expresiei miR-17-5p a indus proliferarea și a inhibat apoptoza celulelor cancerului pulmonar, în timp ce a redus sensibilitatea celulelor cancerului pulmonar la Gefitinib [14]. În plus, miR-17-5p a fost considerat o potențială țintă terapeutică pentru leziunile aterosclerotice [15], inflamația retinei [16], osteonecroza netraumatică a capului femural [17] și ficatul gras [18]. Cu toate acestea, nu a fost efectuat niciun studiu pentru a explora rolul miR-17-5p în rinită.
Lipopolizaharida (LPS), un agonist al receptorului de tip 4, este principala componentă a peretelui celular al bacteriilor Gram-negative. Funcția sa principală este menținerea integrității structurale a celulei bacteriene [19]. LPS acționează, de asemenea, ca o endotoxină care produce un răspuns imun puternic și inflamație [20]. Studiile au folosit deja leziuni celulare epiteliale nazale induse de LPS ca model de rinită [19]. În acest studiu am explorat rolul miR-17-5p în deteriorarea celulelor epiteliale nazale induse de LPS și am încercat, de asemenea, să explorăm căile și țintele moleculare de bază.
Metode
Cultura și tratamentul celular
Linia de celule epiteliale nazale umane (RPMI2650) a fost achiziționată de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, SUA). Celulele RPMI2650 au fost cultivate în mod obișnuit în RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS; Sigma, St. Louis, MO, SUA) în prezența penicilinei/streptomicinei (Sigma, St. Louis, MO, SUA) la 37 ° C într-o cameră umidificată cu 5% CO2. Celulele au fost tratate cu LPS (5 μg/ml) timp de 12 ore.
transfecția miARN
Scramble, siNC, si-miR-17-5p și miR-17-5p mimic au fost sintetizate de GenePharma Co (Shanghai, China). Transfecțiile celulare au fost efectuate folosind reactivul Lipofectamine 3000 (Invitrogen) conform protocolului producătorului.
PCR cantitativ în timp real (RT-PCR)
ARN-urile din celulele cultivate au fost extrase folosind kitul de extracție rapidă ARN pur (Bioteke Corporation, Beijing, China) conform instrucțiunilor producătorului. Pentru transcrierea inversă a miARN, sinteza ADNc într-o singură etapă a fost făcută prin adăugarea cozii poli (A) la capătul 3 'al miARN cu primer adaptor oligo (dT) și transcriptază inversă Super M-MLV (Bioteke Corporation, Beijing, China). Pentru ARNm, ARN-urile totale au fost transcrise invers într-un sistem de reacție care conțin primeri aleatori și transcriptază inversă M-MLV. Ulterior, produsele de transcripție inversă (ADNc) au fost amplificate utilizând reacția în lanț a polimerazei în timp real (RT-PCR) cu Master Mix verde SYBR; RT-PCR a fost efectuat în blocul termic cantitativ Exicycler 96 în timp real (BIONEER, Daejeon, Coreea de Sud). U6 a fost utilizat ca control intern pentru analiza expresiei miARN, în timp ce GAPDH a fost utilizat ca control intern pentru determinarea nivelurilor de expresie a ARNm. Condițiile RT-PCR au fost următoarele: incubare inițială de 10 min la 95 ° C, apoi 40 de cicluri la 95 ° C timp de 10 s, la 60 ° C timp de 20 s și la 72 ° C timp de 30 s, urmată de 5 min incubație la 4 ° C. Analiza relativă de cuantificare a fost efectuată folosind metoda CT 2 - △ △. Fiecare probă a fost analizată în trei exemplare și toate experimentele au fost efectuate de trei ori independent.
Transfecția și generarea de linii celulare transfectate stabil
Secvențe Smad7 de lungime completă și ARN cu ac scurt de păr îndreptate împotriva Smad7 au fost construite în plasmide pEX-2 și respectiv U6/GFP/Neo (GenePharma). Au fost denumiți pEX-Smad7 și respectiv sh-Smad7. Reactivul lipofectamină 3000 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, SUA) a fost utilizat pentru transfecția celulelor conform instrucțiunilor producătorului. Plasmida care poartă o secvență care nu vizează a fost utilizată ca un control negativ (NC) al sh-Smad7 denumit sh-NC. Celulele transfectate stabil au fost selectate folosind mediu de cultură conținând 0,5 mg/ml G418 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SUA). După aproximativ 4 săptămâni, s-au stabilit clone celulare rezistente la G418.
Analiza CCK-8
Celulele au fost însămânțate într-o placă cu 96 de godeuri cu 5000 de celule/godeu. Viabilitatea celulară a fost evaluată de un kit de numărare a celulelor-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD). Pe scurt, după stimulare, soluția CCK-8 a fost adăugată la mediul de cultură și culturile au fost incubate timp de 1 oră la 37 ° C în aer umidificat 95% și 5% CO2. Absorbanta a fost masurata la 450 nm folosind un cititor de microplaci (Bio-Rad, Hercules, CA).