Metformina crește activitatea proteinei kinazei activată cu AMP la mușchiul scheletic al subiecților cu tip

Abstract

Metformina este unul dintre cele mai frecvent utilizate medicamente pentru tratamentul diabetului de tip 2. Este un medicament hipoglicemiant eficient care îmbunătățește, de asemenea, profilurile lipidice (1) și reduce riscul cardiovascular (2). Programul de prevenire a diabetului sa dovedit recent a fi similar cu dieta și exercițiile fizice, tratamentul cu metformină reduce riscul de a dezvolta diabet la persoanele cu intoleranță la glucoză (3). În timp ce majoritatea studiilor au arătat că efectele de scădere a glucozei ale metforminei sunt secundare unei scăderi a producției hepatice de glucoză (1,4-6), un corp semnificativ de date sugerează, de asemenea, că acest medicament crește eliminarea glucozei în mușchiul scheletic (1,7, 8); cu toate acestea, locul său molecular de acțiune rămâne neclar.

activitatea

Proteina kinază activată cu AMP (AMPK) este o enzimă heterotrimerică compusă dintr-o subunitate catalitică (α) și două subunități reglatoare (β și γ) (9,10). Există două izoforme ale subunității catalitice: AMPK α1, care este distribuită pe scară largă, și AMPK α2, care se exprimă în mușchiul scheletic, inima și ficatul (11). AMPK funcționează ca un indicator de combustibil intracelular care se activează prin scăderea raportului ATP/ADP și fosfocreatină (PCr)/creatină prin mecanisme care implică fosforilarea de către una sau mai multe kinaze AMPK din amonte, activarea alosterică și o scădere a acțiunii inhibitoare a fosfatazelor ( 9,12, 13). Creșterea activității AMPK are ca rezultat stimularea absorbției glucozei în mușchi, oxidarea acizilor grași în mușchi și ficat și inhibarea producției hepatice de glucoză, a sintezei colesterolului și a trigliceridelor și a lipogenezei (14).

Activarea chimică a AMPK cu compusul 5-aminoimidazol-4-carboxamidă ribonucleozidă (AICAR) duce la creșterea absorbției glucozei (15-19) și la sensibilitatea crescută la insulină în mușchi (20,21). AICAR nu poate stimula absorbția de glucoză musculară la șoarecii care poartă un mutant AMPK mort kinazic în mușchi (19). În celulele hepatice, activarea AMPK cu AICAR determină inhibarea producției de glucoză (22-24). Pe baza acestor asemănări între efectele metabolice ale AICAR și ale metforminei în ficat și mușchi, am testat anterior posibilitatea ca AMPK să poată fi implicat în medierea acțiunilor metabolice ale metforminei în țesutul animal (25). Metformina a crescut semnificativ activitatea AMPK în hepatocitele de șobolan cultivate și în mușchii izolați și, important, activarea enzimei a fost asociată cu producția diminuată de glucoză de către hepatocite și cu o absorbție mai mare de glucoză musculară (25). Pentru a investiga dacă activarea AMPK de către metformină este un mecanism probabil pentru efectele sale metabolice la subiecții cu diabet zaharat de tip 2, în studiul de față, am examinat dacă tratamentul cu acest medicament modifică activitatea isoformelor AMPK α1 și α2 în mușchiul scheletic.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Subiecte.

Opt subiecți cu diabet zaharat de tip 2 (șapte bărbați și o femeie) au fost studiați înainte, în timpul și după 10 săptămâni de tratament cu metformină. Studiul a fost aprobat de Comitetul Etic al Institutului Karolinska. Subiecții au fost informați cu privire la scopul studiului și la potențialele efecte secundare ale medicamentului. Consimțământul scris a fost obținut de la toți subiecții. Diagnosticul diabetului de tip 2 a fost pus de către medicii subiecților pe baza criteriilor publicate (26). Creatinina serică și amino transferazele au fost măsurate la momentul inițial pentru a exclude bolile renale sau hepatice în curs de desfășurare. Trei subiecți luau o sulfoniluree, doi metformină și trei o combinație a ambelor medicamente. Subiecții au fost excluși dacă au avut antecedente de boli sistemice (altele decât diabetul) sau au luat orice alt medicament despre care se știe că afectează metabolismul carbohidraților în mușchi.

Protocol de studiu.

Testul activității AMPK și imunoblotarea.

Probele de mușchi au fost omogenizate așa cum s-a descris anterior (29), iar lizatele au fost utilizate pentru determinarea activității AMPK și imunoblotarea. Activitatea AMPK a fost determinată după imunoprecipitarea a 200 μg de proteine ​​folosind anticorpi specifici produși împotriva secvențelor de aminoacizi 339-358 ale AMPK α1 și 352-366 din α2 așa cum s-a descris anterior (29). Reacția a fost făcută utilizând peptida sintetică HMRSAMSGLHLVKRR ca substrat (30). Activitatea AMPK este exprimată ca ATP încorporat (picomoli) pe miligram de proteină pe minut. Imunoblotarea s-a făcut așa cum s-a descris anterior (29). Pe scurt, proteinele (60 μg) din lizatele musculare au fost separate cu 8% SDS-PAGE și transferate în membranele nitrocelulozice. După blocare, membranele au fost incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorpul împotriva AMPK α2 descris mai sus (3 μg/ml) sau cu anti-fosfo-AMPK (Thr172) (3 μg/ml; Cell Signaling, Beverly, MA). Anticorpii legați au fost detectați cu anticorp întreg legat de peroxidază de imunoglobulină anti-iepure și prin utilizarea reactivilor chemiluminescenți îmbunătățiți (ECL) (NEN Life Science Products, Boston, MA). Membranele au fost expuse la film, iar benzile au fost cuantificate utilizând software-ul ImageQuant (Molecular Dynamics).