Măsurarea efectului unei diete occidentale asupra arhitecturii țesuturilor hepatice prin autofluorescență FLIM și
Suman Ranjit
1 Laborator pentru dinamica fluorescenței, Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea din California, Irvine, CA, SUA
Alexander Dvornikov
1 Laborator pentru dinamica fluorescenței, Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea din California, Irvine, CA, SUA
Evgenia Dobrinskikh
2 Departamente de Medicină, Universitatea Colorado-Anschutz Medical Campus, Aurora, Colorado, SUA
Xiaoxin Wang
2 Departamente de Medicină, Universitatea Colorado-Anschutz Medical Campus, Aurora, Colorado, SUA
Yuhuan Luo
2 Departamente de Medicină, Universitatea Colorado-Anschutz Medical Campus, Aurora, Colorado, SUA
Moshe Levi
2 Departamente de Medicină, Universitatea Colorado-Anschutz Medical Campus, Aurora, Colorado, SUA
Enrico Gratton
1 Laborator pentru dinamica fluorescenței, Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea din California, Irvine, CA, SUA
Abstract
Abordarea fazorică a imaginii cu autofluorescență pe durata vieții a fost utilizată pentru a identifica și caracteriza o specie cu durată lungă de viață (LLS) (
7,8 ns) la ficatul șoarecilor hrăniți cu o dietă occidentală. Mărimea suprafețelor care conțin această specie LLS depinde de tipul dietei, iar distribuția mărimii arată că dieta occidentală are dimensiuni LLS mult mai mari. Combinația de imagini de a treia generație de armonici cu FLIM a identificat speciile LLS cu picături de grăsime și a fost estimată distribuția dimensiunii picăturilor. A doua microscopie de generație armonică combinată cu FLIM fazor arată că există o creștere a fibrozei cu o dietă occidentală. O nouă descompunere în trei componente ale graficului fazor arată că o dietă occidentală este corelată cu o fracțiune mai mare de NADH liber, ceea ce înseamnă o stare mai redusă și o stare mai glicolitică. Analiza multiparametrică a distribuției fazorului arată că, din distribuția punctelor fazorale, se poate separa o dietă occidentală hrănită față de o dietă cu conținut scăzut de grăsimi hrănite cu ficți de șoareci. Abordarea fazorică pentru analiza imaginilor FLIM ale autofluorescenței la specimenele de ficat poate duce la descoperirea de noi specii fluorescente și apoi aceste noi specii fluorescente pot ajuta la evaluarea arhitecturii țesuturilor. În cele din urmă, integrarea FLIM și a doua și a treia analiză armonică oferă o măsură a progresului fibrozei ca efect al dietei.
1. Introducere
7,8 ns) găsite în picăturile de grăsime din țesuturile hepatice rezultate din dieta occidentală. Anterior, această specie de lungă durată a fost observată în celulele hrănite cu acid oleic sau când celulele sunt sub hipoxie pentru a produce specii reactive de oxigen (ROS) sau în țesuturile adipoase de șoarece [22, 23]. Semnătura Raman pentru trigliceride coincide cu prezența acestei specii LLS în aceste picături sub tratament cu acid oleic [22]. Oxidarea ROS a moleculelor de grăsime este cauza probabilă a formării LLS și aici am folosit acest semnal LLS pentru a identifica și distinge efectul dietei occidentale asupra secțiunilor de țesut hepatic.
Microscopul utilizat pentru măsurătorile noastre se bazează pe un detector de direcție directă în care datele sunt achiziționate în direcția de excitație și este extrem de sensibil pentru imagistica armonică [24-26]. În lucrarea descrisă în această lucrare, am folosit imagistica a treia generație de armonici, care este deosebit de sensibilă la limitele picăturilor de grăsime pentru a arăta că componenta LLS coincide cu picăturile [27]. De asemenea, am folosit o abordare combinatorie a FLIM și a doua generație de armonici (SHG) pentru a cuantifica gradul de fibroză din țesuturile hepatice [28-32].
2. Metode
2.1 Modelul animalului și pregătirea feliei de țesut
Șoareci masculi C57BL/6J de 8 săptămâni au fost obținuți de la Jackson Labs. Aceștia au fost hrăniți cu o dietă de control echivalentă cu conținut scăzut de grăsimi (LF, 10 kcal% grăsime) sau o dietă occidentală (WD, 42 kcal% grăsime din lapte, 34% zaharoză, 0,2% colesterol) timp de 6 luni. Studiile pe animale și protocoalele relative au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Colorado Denver. Toate experimentările pe animale au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
La sfârșitul perioadei de hrănire șoarecii au fost anesteziați și ficății au fost îndepărtați și prelucrați congelați în compusul OCT (Temperatura optimă de tăiere) sau fixat în formalină și încorporat parafină (FFPE). Țesutul a fost feliat în 5 secțiuni groase de 5 m și această secțiune a fost montată pe o lamă. Compusul OCT a fost îndepărtat folosind tampon DPBS (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) și felia a fost montată pe o lamă de acoperire folosind același tampon. Feliile de parafină s-au imaginat cu secționarea optică după lamele de „suport” la 60 ° C fără îndepărtarea în continuare a parafinei cu xilen și etanol.
2.2 Achiziționarea datelor: abordare DIVER și fazorică a FLIM
2.3 Analiza datelor
2.3.1 Analiza fazorului
Semnalele fluorescente și armonice colectate din fiecare punct al imaginii au fost transformate în spațiul fazor folosind următoarea transformare [20, 33, 34]
unde, si, j (ω) și gi, j (ω) sunt coordonatele Y și X în diagrama fazorului, respectiv; ω este frecvența de repetare a sursei laserului în radiani, T este perioada frecvenței de repetare a laserului și n este frecvența armonică. Ii, j este degradarea intensității măsurată la fiecare pixel din imaginea optică originală. Fluorescența colectată de la fiecare pixel al unei imagini este transformată într-un punct din diagrama fazorului. Modificările în metabolism și acumularea de lipide datorate modificărilor dietei pot schimba poziția punctelor fazorale și modelul de distribuție generală a graficului fazoric. Un set de puncte de fazor poate fi apoi ales cu ajutorul unui cursor colorat, iar imaginea corespunzătoare poate fi colorată corespunzător. Descriem mai multe moduri diferite de a analiza distribuția fazorului pentru a cuantifica diferite specii din țesutul observat.
2.3.2 Calculul dimensiunii picăturilor lipidice
Locația speciilor cu durată lungă de viață în graficul fazor a fost selectată cu cursorul roșu și imaginile FLIM au fost colorate corespunzător (Fig. 1 (d)). Specia LLS este prezentă numai în picăturile de lipide. Astfel, dimensiunea picăturilor poate fi măsurată prin măsurarea dimensiunii ariei imaginilor acoperite de LLS. Există un număr mare de picături de dimensiuni foarte mici, care sunt de obicei prezente în țesuturile hepatice. O prag de> 85 µm 2 în distribuția mărimii pentru picăturile de grăsime are ca rezultat o mai bună separare a imaginilor de țesuturile hepatice ale dietei occidentale bogate în grăsimi și ale celei slabe de control al grăsimilor. Dimensiunile picăturilor pot fi apoi reprezentate printr-un grafic cutie sau prin histograme (Fig. 1 (e) și 1 (f). Graficul cutiei arată cum se modifică deviația medie și standard a dimensiunii picăturilor în funcție de tipul Histograma arată cum picăturile pentru dieta occidentală se extind la dimensiuni mult mai mari decât cele observate pentru probele de dietă cu conținut scăzut de grăsimi.