Lipsa FFAR1GPR40 nu protejează șoarecii de o dietă bogată în grăsimi - diabet zaharat indus de boli metabolice

Abstract

OBIECTIV-FFAR1/GPR40 este un receptor cuplat cu proteina G exprimat predominant în insulele pancreatice care mediază secreția de insulină indusă de acidul gras liber. Cu toate acestea, rolul fiziologic al FFAR1 rămâne controversat. S-a raportat anterior că șoarecii knockout FFAR1 (Ffar1 -/-) erau rezistenți la hiperinuslinemia, hiperglicemia, hipertrigliceridemia și steatoza hepatică indusă de dietă bogată în grăsimi. Un raport mai recent a sugerat că, deși FFAR1 a fost necesar pentru secreția de insulină indusă de acizi grași in vivo, ștergerea FFAR1 nu a protejat insulele pancreatice împotriva disfuncției insulelor induse de acidul gras. Acest studiu este conceput pentru a investiga funcția FFAR1 in vivo folosind o a treia linie de șoareci Ffar1 -/- generați independent în fundalul C57BL/6.

lipsa

PROIECTARE ȘI METODE DE CERCETARE—Am folosit CL-316,243, un agonist al receptorilor adrenergici β3, pentru a ridica acut acizii grași fără sânge și pentru a studia efectul acestuia asupra secreției de insulină in vivo. Șoarecii Ffar1 +/+ (de tip sălbatic) și Ffar1 -/- (knockout) au fost plasați pe două diete distincte bogate în grăsimi pentru a studia răspunsul lor la obezitatea indusă de dietă.

REZULTATE—Secreția de insulină a fost redusă cu -50% la șoarecii Ffar1 -/-, confirmând faptul că FFAR1 contribuie semnificativ la stimularea acizilor grași a secreției de insulină in vivo. Cu toate acestea, șoarecii Ffar1 +/+ și Ffar1 -/- au avut greutate, adipozitate și hiperinsulinemie similare la dietele bogate în grăsimi, iar șoarecii Ffar1 -/- nu au prezentat nicio îmbunătățire a testelor de toleranță la glucoză sau insulină. În plus, dieta bogată în grăsimi a indus niveluri comparabile de acumulare de lipide la ficatul șoarecilor Ffar1 +/+ și Ffar1 -/-.

CONCLUZII—FFAR1 este necesar pentru secreția normală de insulină ca răspuns la acizi grași; cu toate acestea, șoarecii Ffar1 -/- nu sunt protejați de rezistența la insulină indusă de dietă bogată în grăsimi sau steatoza hepatică.

Acizii grași sunt implicați într-o gamă diversă de funcții fiziologice într-o varietate de țesuturi. Se crede că multe dintre efectele acizilor grași sunt mediate de metaboliții intracelulari ai esterilor acil-CoA cu lanț lung. Cu toate acestea, în ultimii ani s-au acumulat dovezi că cel puțin unele dintre activitățile atribuite acizilor grași sunt mediate prin interacțiunea lor cu un număr de receptori cuplați cu proteine ​​G desemnați FFAR1 (GPR40), FFAR2 (GPR43), FFAR3 ( GPR41), GPR120 și GPR84. FFAR2 și FFAR3 sunt activate de acizii grași cu lanț scurt, în timp ce FFAR1, GPR84 și GPR120 sunt activate de acizii grași cu lanț mediu sau lung (1). Dintre acești receptori, FFAR1 și GPR120 au atras atenția pentru potențialul lor ca ținte terapeutice pentru bolile metabolice (2-4).

Aici, raportăm fenotipurile metabolice pe o a treia linie independentă de șoareci Ffar1 -/- generați în fundalul C57BL/6Ncrl (B6). Am constatat că FFAR1 contribuie la ~ 50% din eliberarea in vivo a insulinei mediată de acizi grași, în concordanță cu raportul anterior al Latour și colab. (7). Spre deosebire de observațiile anterioare ale lui Steneberg și colab. (5), totuși, șoarecii noștri Ffar1 -/- nu sunt protejați de efectele negative ale dietei bogate în grăsimi. Șoarecii Ffar1 -/- pe o dietă bogată în grăsimi au devenit obezi, au dezvoltat rezistență la insulină și au acumulat lipide hepatice într-o măsură similară, în comparație cu colegii Ffar1 +/+. Luate împreună, datele noastre confirmă faptul că FFAR1 este important pentru secreția de insulină mediată de acizi grași, dar pune sub semnul întrebării rolul său în medierea efectelor toxice ale acizilor grași liberi asupra bolilor metabolice.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Generarea șoarecilor Ffar1 -/- în fundalul C57BL/6NCrl (B6).

Șoarecii Ffar1 -/- au fost generați personalizat de DeltaGen (Palo Alto, CA). Pe scurt, un vector de direcționare a fost conceput pentru a șterge un fragment de 152 bp corespunzător poziției 143-294 a cadrului de citire deschis al genei Ffar1 (NM_194057). Acest segment a fost înlocuit cu o casetă Neomycin (neo). Vectorul a fost electroporat în celule stem embrionare derivate de 129/OlaHsd (ES), iar coloniile de celule ES rezistente la G418 au fost apoi selectate și extinse pentru analiza ADN. Celulele ES vizate corect au fost injectate în blastocisti pentru a genera șoareci himerici care au fost apoi împerecheați cu femele B6. Descendenții heterozigoți Ffar1 (Ffar1 +/-) au fost identificați printr-o strategie de screening bazată pe PCR. Primerii PCR au fost proiectați pentru a detecta atât alelele de tip sălbatic (234-bp), cât și alelele knockout (399-bp). Secvențele oligonucleotidice au fost după cum urmează: Ffar1 în amonte de regiunea eliminată înainte, 5'-cccagcttggtctacactctccatc-3 '; Ffar1 în aval de regiunea ștearsă inversă, 5′-gatggcttggtacccgaaggggaag-3 ′; și neo înainte, 5′-gggtgggattagataaatgcctgctct-3 ′. Șoarecii Ffar1 +/− au fost apoi încrucișați pentru a genera șoareci Ffar1 -/-. Șoarecii Ffar1 -/- au fost încrucișați la șoareci C57BL/6NCrl timp de> 10 generații pentru a genera șoareci într-un fundal B6.

Secreția de insulină in vivo ca răspuns la acizi grași liberi acut crescuți.

Șoarecii Ffar1 +/+ și Ffar1 -/- nedeclarați, în funcție de vârstă și sex, au primit injecție intraperitoneală fie cu soluție salină, fie cu agonistul β3 CL-316,243 (Sigma-Aldrich) la 1 mg/kg (8). La cincisprezece minute după injectare, s-au colectat ~ 700 μl de sânge de la fiecare șoarece prin puncție cardiacă imediat după asfixierea CO2. Pentru a păstra peptida 1 asemănătoare glucagonului (GLP-1), s-a adăugat inhibitor DPP-IV (Linco) la tuburile pre-răcite de colectare a sângelui (BD Microtainer 365974; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) și plasmă izolată prin centrifugare la 5.000 rpm timp de 10 min, menținând o temperatură de 4 ° C. Alicote de probe de plasmă au fost depozitate la -80 ° C până la analiză. Nivelurile plasmatice de insulină și GLP-1 (7-36) amidă au fost estimate folosind kituri de la Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD). Nivelurile de leptină, amilină și glucagon au fost măsurate folosind trusele Lincoplex Luminex (Linco Research, St. Charles, MO). Glucoza, acizii grași liberi și trigliceridele au fost măsurate folosind truse comerciale de la Wako Diagnostics (Richmond, VA).