Endotelina Un blocaj al receptorilor previne nepotrivirea capilară a miocitelor în inima animalelor uremice
Abstract
Multe studii experimentale (1,2,3,4) și clinice (5,6,7,8,9) documentează un rol patogenetic al vasoconstrictorului puternic și al agentului mitogen endotelină-1 (ET-1) în bolile cardiovasculare. Un efect benefic al antagoniștilor receptorilor ET-1 a fost observat în insuficiența cardiacă congestivă (10,11,12). În acest context, efectele antagoniștilor receptorilor ET asupra structurii și funcției cardiace sunt de interes.
În hipertrofia ventriculară stângă (LVH), cardiomiocitele tind să depășească aportul capilar (13,14,15,16), ducând la nepotrivire capilar-miocit. Acest lucru a fost deosebit de bine documentat în insuficiența renală cronică, atât la animale (17,18), cât și la oameni (19). În modelul insuficienței renale, se știe că geneza LVH este parțial independentă de creșterea TA (20). Cu toate acestea, nu s-a determinat dacă antagoniștii receptorilor ET afectează capilarizarea cardiacă în raport cu masa ventriculară stângă (adică raportul capilar-miocit, care este un factor determinant important al aportului de oxigen cardiomiocitar).
Deoarece există dovezi că sistemul ET local este activat în LVH (1,2,3,4,5), am motivat că LVH uremic a furnizat un model convenabil pentru a examina ipoteza că un antagonist selectiv al receptorilor ETA previne nepotrivirea capilară-miocit în inimile șobolanilor cu insuficiență renală cronică. În acest scop, am comparat efectul blocantului specific al receptorului ETA LU 135252 (și al inhibitorului enzimei de conversie a angiotensinei [ACE] trandolapril ca control) asupra densității lungimii capilare cardiace.
Materiale și metode
Animale
Protocolul pentru acest studiu este conform cu liniile directoare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator publicate de Institutul Național de Sănătate și a fost aprobat de comitetul etic local.
Proiectare experimentală
Șobolani masculi Sprague-Dawley în vârstă de nouă săptămâni (SD, 220 g; Janvier, Le Genest St. Isle, Franța) au fost adăpostiți în cuști individuale la temperatură constantă (22 ° C) și umiditate (50%) și au fost expuși la o Ciclu de întuneric/lumină de 12 ore. Animalele au avut acces gratuit la o dietă scăzută de nitrozamină (1% NaCl, furaje pudrate Ssniff M/R, Sniff Spezialitäten GmbH, Soest, Germania) și apă. După 3 zile de adaptare, animalele au fost alocate aleatoriu la nefrectomie subtotală (SNX) sau operație simulată (simulată). Mai întâi, rinichiul drept a fost îndepărtat sub anestezie cu ketamină/diazepam (100 mg/kg sau 2,5 μg/kg, respectiv), apoi rinichiul stâng a fost resectat subtotal prin îndepărtarea a două treimi (în greutate) a rinichiului contralateral, în principal prin rezecția țesut cortical. Operația simulată a animalelor de control a constat în decapsularea rinichiului, având grijă specială ca suprarenalele să nu fie deteriorate. La 24 de ore după operație, animalele au fost alocate aleatoriu diferitelor grupuri de tratament. Au fost efectuate două experimente separate.
Experimentul I: Studiu biologic imunohistochimic și molecular. Animalele au fost repartizate aleatoriu în cele două grupuri experimentale (10 animale pe grup): (1) controale acționate în mod fals și (2) SNX netratat. Greutatea corporală, aportul de alimente și apă și TA sistolică au fost determinate înainte de operație și în două intervale săptămânale în timpul studiului. Măsurătorile TA au fost efectuate la animale conștiente folosind pletismografia cozii. Înainte de terminarea experimentului, animalele au fost plasate în cuști metabolice individuale și s-au efectuat colectări de urină 24 de ore pentru determinarea volumului de urină, proteinuriei, clearance-ului creatininei și concentrațiilor imunoreactive de ET-1.
Pregătirea țesuturilor. La sfârșitul experimentului, aorta abdominală a fost cateterizată sub anestezie cu ketamină/diazepam (100 mg/kg sau 2,5 μg/kg, respectiv) și s-au prelevat probe de sânge pentru determinarea parametrilor serici și a nivelurilor plasmatice ale medicamentelor utilizate. Apoi perfuzia vasculară retrogradă a fost efectuată cu NaCI rece cu gheață la o presiune controlată așa cum este descris în detaliu în altă parte (21). Inimile au fost împărțite în trei felii orizontale și congelate în azot lichid pentru imunohistochimie, măsurători PCR și hibridizare in situ. Au fost determinate hematocritul, creatinina serică, creatinina urinară și renina plasmatică (22).
Imunohistochimie. Secțiunile înghețate (5 μm) au fost fixate în acetonă la 4 ° C. Colorarea imunohistologică a fost efectuată folosind un anticorp policlonal ET-1 neconjugat (Bio Trend GmbH, Köln, Germania). Pentru a reduce colorarea nespecifică a fundalului, secțiunile au fost incubate timp de 20 de minute la 37 ° C în factorul de demascare a țesutului. Probele au fost apoi clătite în soluție salină tamponată cu Tris (TBS, pH 7,6) și supuse sistemului avidin-biotină. Pe scurt, lamelele au fost incubate cu anticorpul primar la o diluție de 1:25 timp de 60 min la temperatura camerei. Anticorpul secundar (biotina imunoglobulinei anti-iepure de capră; Biogenex, San Ramon, CA) a fost aplicat timp de 30 de minute. Apoi secțiunile au fost incubate timp de 30 de minute la temperatura camerei cu streptavidină conjugată alcalină-fosfatază labilă super-sensibilă (Biogenex). Fiecare etapă de incubație a fost urmată de o clătire dublă aprofundată în TBS. Substratul roșu rapid (Dako GmbH, Hamburg, Germania) a servit drept cromogen. Ulterior, secțiunile au fost contracolorate cu hematoxilină și examinate prin microscopie cu lumină. Anticorpul utilizat a fost testat pentru specificitate la șobolan. Controalele negative au fost efectuate prin omiterea anticorpului primar. Colorarea secțiunilor de control și SNX a fost efectuată în aceeași perioadă pentru a reduce variațiile de intensitate a colorării.
Oligonucleotide. Am amplificat receptorul ETA (ET-AR) și receptorul ETB (ET-BR) folosind oligonucleotidele date de Liefeldt și colab. (23). Pentru ET-AR, am folosit ca grund de sens 5'-TGGGAATGGTGGGGAATG CAACTCT-3 'și ca grund antisens 5'-GAGCGCAGAGGTTGAGGACGGTGA-3', rezultând un produs PCR cu lungimea de 258 bp. Pentru ET-BR, primerul de sens a fost 5'-TTGGAGCTGAGATGT GTAAGC-3 'și primerul antisens a fost 5'-CAGTGAAGCCATGTTGATACC-3', rezultând un produs de amplificare de 625 pb. Pentru ET-1, primerul de sens a fost 5'-TGGCTTTCCAAGGAGC TCC-3 'și primerul antisens a fost 5'-GCTTGGCAGAAATTCCAGC-3', rezultând un fragment PCR de 339 bp.