Interacțiunea subunității p70 a RPA cu un șablon de ADN direcționează p32 către capătul 3 ′ - ADN născut

Institutul de Chimie Bioorganică, Divizia Siberiană a Academiei de Științe din Rusia, 630090 Novosibirsk, Rusia

Institutul pentru Biotehnologie Moleculară Jena, D-07708 Jena, Germania

Institutul de Chimie Bioorganică, Divizia Siberiană a Academiei de Științe din Rusia, 630090 Novosibirsk, Rusia

Departamentul de Biologie Moleculară, Universitatea Vanderbilt, Nashville, TN 37235, SUA

Institutul Jacques Monod (CNRS, Universite Paris 6, Universite Paris 7), 75351 Paris Cedex 05, Franța

Institutul de Chimie Bioorganică, Divizia Siberiană a Academiei de Științe din Rusia, 630090 Novosibirsk, Rusia

Autorul corespunzator. Fax: (7) (38) 3233 3677 Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Institutul de Chimie Bioorganică, Divizia Siberiană a Academiei de Științe din Rusia, 630090 Novosibirsk, Rusia

Institutul pentru Biotehnologie Moleculară Jena, D-07708 Jena, Germania

Institutul de Chimie Bioorganică, Divizia Siberiană a Academiei de Științe din Rusia, 630090 Novosibirsk, Rusia

Departamentul de Biologie Moleculară, Universitatea Vanderbilt, Nashville, TN 37235, SUA

Institutul Jacques Monod (CNRS, Universite Paris 6, Universite Paris 7), 75351 Paris Cedex 05, Franța

Institutul de Chimie Bioorganică, Divizia Siberiană a Academiei de Științe din Rusia, 630090 Novosibirsk, Rusia

Autorul corespunzator. Fax: (7) (38) 3233 3677 Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Abstract

Proteina de replicare umană A este o proteină heterotrimerică implicată în diferite procese de metabolizare a ADN-ului. Pentru a înțelege contribuția proteinei de replicare A subunități individuale la legarea ADN-ului, le-am exprimat separat ca proteine de fuziune a proteinelor solubile de legare a maltozei. Folosind o construcție de ADN care avea o grupă fotoreactivă încorporată la capătul 3 ′ - capătului de grund, arătăm că subunitatea p70 de la sine este legată în mod eficient de grund la concentrații fiziologice. În schimb, reticularea subunității p32 a necesitat două concentrații mai mari de proteine. În niciun caz subunitatea p14 nu a fost marcată deasupra fundalului. p70 pare a fi subunitatea predominantă pentru a lega ADN monocatenar și această interacțiune poziționează subunitatea p32 la capătul 3 ′ - primer.

1. Introducere

Deși pare clar că p70 se leagă predominant de regiunea ssDNA și contactele p32, dacă este deloc, exemplul terminal, nu se știe cum fiecare dintre subunitățile unice contribuie în sine la legarea ADN-ului. Aici, demonstrăm că este în principal subunitatea p70 care poate contacta ADN-ul pe cont propriu și că contactele p32 sunt disponibile numai în complex prin poziționarea de către subunitatea p70.

2. Materiale și metode

2.1 Materiale

ADN polimeraza β (pol β) recombinantă de mamifer a fost purificată așa cum este descris [4]. RPA a fost exprimat în Escherichia coli și purificat așa cum este subliniat [5, 6]. Markerii de masă moleculară a proteinelor colorate în curcubeu au fost de la Amersham, markerii precolorați din New England Biolabs și scara de 10 kDa de la Gibco BRL. Polinucleotid kinaza T4 a fost achiziționată de la New England Biolabs. [γ‐ 32 P] ATP a fost de la ICN. Oligonucleotidele sintetice au fost obținute de la GENSET. Nensorb −20 coloane provin de la Du Pont. NAB-4-dUTP a fost sintetizat conform lui Wlassoff și colab. [7]. Subunitățile RPA individuale au fost exprimate ca proteine de fuziune a proteinei de legare a maltozei (MBP) și izolate așa cum va fi descris în altă parte.

2.2 Teste de schimbare a benzii

Analize de deplasare de bandă conținute într-un amestec de 10 μl, 20 mM HEPES - KOH pH 7,8, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 200 ng (corespunzător 0,083 pmol) ADN M13mp18 (Pharmacia) și cantitățile indicate de RPA sau Proteine de fuziune MBP subunitate RPA. După 30 de minute la 37 ° C, proba a fost suplimentată cu 2 μl tampon de încărcare (10 mM HEPES - KOH pH 7,5, 1 mM EDTA, 25% Ficoll 400, 0,1% albastru de bromofenol) și electroforezat într-un gel de agaroză 1% în TAE tampon (Tris-acetat 40 mM, EDTA 1 mM). Gelul a fost colorat cu 0,5 μg/ml bromură de etidiu și ADN-ul a fost vizualizat pe un transiluminator UV.

Testele de deplasare a benzii au fost, de asemenea, stabilite folosind oligonucleotide marcate cu 5 ′. În aceste cazuri, testul conținea 2 fmol (10.000 cpm) din oligonucleotida indicată în locul ssDNA M13mp18. După incubare, probele au fost separate pe geluri de poliacrilamidă 10% în TBE (Tris - borat 89 mM, acid boric 89 mM) la 160 V până când colorantul albastru de bromofenol a migrat pe jumătate în gel. Gelul a fost uscat și expus la pelicule cu raze X.

2.3 Marcarea radioactivă a primerilor oligonucleotidici

Primerii defosforilați au fost fosforilați la capătul 5 ′ cu polinucleotid kinază T4 așa cum este descris [8]. [Γ‐ 32 P] ATP nereacționat a fost îndepărtat prin trecerea amestecului peste o coloană Nensorb - 20 folosind protocolul sugerat de producător.

2.4 Exemplu - recoacere șablon

Primer - șabloanele au fost recoapte la un raport molar de 1: 1, mai întâi prin încălzirea amestecului la 90 ° C timp de 1 min, care a fost apoi lăsat să se răcească încet la temperatura camerei. Secvențele exemplului și șablonului utilizate au fost următoarele: 5 ′ - GGTTCGATATCGTAGTTCTAGTGTATAGCCCCTACC - 3 ′, 3 ′ - CACATATCGGGGATGG - 5 ′

2.5 Exemplu de alungire în prezența analogilor dNTP fotoreactivi

Condițiile pentru alungirea oligonucleotidelor de către analogii fotoreactivi ai dNTP au fost identice cu cele utilizate pentru fotocrosslinking. Sinteza ADN-ului a fost inițiată prin adăugarea de polimerază și efectuată timp de 30 de minute la 25 ° C. Reacția a fost încheiată prin adăugarea a 10 pl de 90% formamidă, 50 mM EDTA și 0,1% albastru de bromofenol. Amestecul a fost încălzit timp de 3 minute la 80 ° C și produsele au fost analizate prin electroforeză urmată de autoradiografie.

2.6 Reticulare fotochimică

RPA și subunitățile sale individuale au fost marcate cu un primer fotoreactiv sintetizat in situ folosind NAB-4-dUTP într-o reacție de alungire a primerului catalizată de pol β. Amestecurile de reacție (10 μl) conțin următoarele componente standard: 50 mM Tris - HCI, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 2 μM pol β, 0,8 μM șablon - 5 ′ - [32 P] primer și 10 μM NAB ‐4 - dUTP. Concentrațiile RPA sau ale subunităților RPA individuale au fost cele indicate. Amestecurile de reacție au fost incubate la 25 ° C timp de 30 de minute pentru a permite alungirea primerului. Apoi, amestecurile au fost observate pe parafilm care a fost plasat pe gheață și UV - iradiat timp de 20 de minute cu un monocromator Baush și Lomb echipat cu o lampă de mercur cu presiune superioară HBO W producând lumină UV de 315 nm. Reacțiile au fost oprite prin adăugarea de tampon Laemmli și încălzire. Probele proteice-ADN reticulate fotochimic au fost separate prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat-poliacrilamidă (SDS-PAGE) [9] și analizate prin autoradiografie sau cu un Phosphorimager.

3. Rezultate

Pentru a dezlega rolurile subunităților individuale în timpul legării ADN-ului, ne-am propus să le exprimăm separat și să le folosim în experimente de reticulare scoase din contextul complexului heterotrimeric. S-a raportat mai devreme că încercările de exprimare a subunităților RPA în mod individual într-o formă solubilă nu au avut succes [10]. Pentru a crește solubilitatea subunităților, le-am exprimat ca proteine de fuziune MBP (Fig. 1A). Am putut exprima toate proteinele de fuziune într-o formă solubilă. Părțile de fuziune ale acestor proteine își pot schimba proprietățile biologice. Într-adevăr, subunitățile RPA de fuziune nu se pot asocia în structura heterotrimerului, dar sugerăm că acestea păstrează activitatea de legare a ADN-ului. Trebuie remarcat faptul că masa moleculară a fiecărei proteine de fuziune MBP crește la 48 kDa în comparație cu cea naturală.