Inhibitorul Mdm2 Nutlin-3a induce apoptoza mediată de p53 prin transcripție dependentă și

• Ecran divizat
• Pictogramă Partajare Acțiune
  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail
• Pictogramă Instrumente Instrumente

  • Kensuke Kojima, Marina Konopleva, Teresa McQueen, Susan O'Brien, William Plunkett, Michael Andreeff; Inhibitorul Mdm2 Nutlin-3a induce apoptoza mediată de p53 prin mecanisme dependente de transcripție și independente de transcripție și poate depăși rezistența mediată de ATM la fludarabină în leucemia limfocitară cronică. Blood 2006; 108 (3): 993–1000. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2005-12-5148

    

    Descărcați fișierul de citare:

    Abstract

    Introducere

    Leucemia limfocitară cronică cu celule B (CLL) reprezintă 25% din toate leucemiile și este cea mai frecventă formă de malignitate limfoidă din țările occidentale. 1 S-a demonstrat că tratamentul cu fludarabină analogică purinică, care este terapia standard curentă pentru LLC, crește rata de remisie completă, crește supraviețuirea fără progresie și crește durata mediană a răspunsului clinic, dar nu și supraviețuirea la pacienții netratați anterior. cu LLC, comparativ cu tratamentul cu clorambucil singur sau chimioterapie combinată. 2-4 Deși introducerea regimurilor combinate pe bază de fludarabină a îmbunătățit succesul general al tratamentului CLL, 5.6 identificarea terapiilor noi pentru CLL rămâne o prioritate ridicată.

    CLL se caracterizează prin acumularea de limfocite CD5 + B de lungă durată care prezintă rezistență la apoptoză. Trifosfatul fludarabinei este încorporat în ADN-ul celulelor CLL în repaus în timpul sintezei ADN-ului reparator și induce leziuni ale ADN-ului. 7-9 Rupturile catenelor de ADN pot duce la activarea genelor țintă dependente de p53 și p53, 10,11 și sa sugerat că inducerea apoptozei mediată de p53 contribuie în primul rând la uciderea in vivo a celulelor CLL indusă de fludarabină. 11,12 De asemenea, sa raportat că fludarabina poate induce apoptoza celulelor CL in vitro într-un mod independent de p53, 13,14, deși semnificația in vivo rămâne necunoscută. 11,12 Din punct de vedere clinic, prezența mutațiilor p53 în celulele CLL este asociată cu scăderea supraviețuirii și rezistența la tratamentul cu fludarabină. 15-17

    În acest studiu, am investigat utilizarea terapeutică potențială a activării p53 de către antagoniștii Mdm2 în LLC. Am constatat că (1) inhibarea Mdm2 induce în mod eficient apoptoza mediată de p53 în celulele CLL independent de nivelurile de expresie Mdm2 sau Atm, (2) apoptoza dependentă de transcripție nu poate fi întotdeauna modul principal prin care p53 induce apoptoza și că activarea exclusivă a calea independentă de transcripție poate induce pe deplin apoptoza și (3) Nutlin-3a și fludarabina induc sinergic apoptoza mediată de p53 în celulele CLL, care poate depăși rezistența la fludarabină în CLL.

    Materiale și metode

    Reactivi

    Antagonistul selectiv al moleculei mici al MDM2, Nutlin-3a (furnizat cu amabilitate de Dr. Lyubomir T. Vassilev, Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ), 27 și 9-β- d -arabinofuranosyl-2-fluoroadenină (F-ara- A, fludarabină) au fost utilizate. În unele experimente, celulele au fost cultivate cu cicloheximidă 3,5 μM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) sau Z-VAD-FMK 200 μM (Alexis, San Diego, CA). Cicloheximida și Z-VAD-FMK au fost adăugate la celule cu 1 oră înainte de administrarea medicamentului. Concentrația finală de dimetil sulfoxid (DMSO) în mediu nu a depășit 0,1% (vol/vol). La această concentrație, DMSO în sine nu a indus apoptoză până la 72 de ore în celulele CLL primare.

    Eșantioane primare și culturi celulare

    Probele de sânge periferic heparinizat au fost obținute de la pacienți CLL netratați anterior cu peste 70% celule maligne după consimțământul informat, în conformitate cu liniile directoare instituționale și Declarația de la Helsinki. Celulele mononucleare au fost purificate prin centrifugare cu gradient de densitate Ficoll-Hypaque (Sigma Chemical, St Louis, MO) și celulele neaderente au fost resuspendate în mediu RPMI 1640 suplimentat cu FCS 10% la o densitate de 5 × 105 celule/ml. Celulele au fost tratate cu Nutlin-3a sau F-ara-A, ambele la 1, 2,5, 5 sau 10 μM și au fost incubate timp de 72 de ore la 37 ° C și 5% CO2 într-o atmosferă umidificată. În experimentele combinate de Nutlin-3a și F-ara-A, cei 2 agenți au fost adăugați simultan la celule la un raport de concentrație fixă ​​(1: 1) și celulele au fost incubate timp de 72 de ore.

    Analiza apoptozei

    Evaluarea apoptozei prin analiza de legare a anexinei V - iodură de propidiu (PI) a fost efectuată așa cum a fost descris. 28 Extinderea apoptozei a fost cuantificată ca procent de celule pozitive ale anexinei V, iar extinderea apoptozei specifice medicamentului a fost evaluată prin următoarea formulă: procentul de apoptoză specifică = (test - control) × 100/(100 - control). În formulă, numeratorul este cantitatea reală de ucidere care a avut loc, iar numitorul este cantitatea potențială de ucidere care ar putea avea loc. Pentru a măsura potențialul membranei mitocondriale (ΔΨm), celulele au fost încărcate cu MitoTracker Red CMXRos (300 nM) și MitoTracker Green (100 μM; ambele de la Molecular Probes, Eugene, OR) timp de 1 oră la 37 ° C. ΔΨm a fost apoi evaluat prin măsurarea retenției CMXRos (fluorescență roșie) în timp ce se ajustează simultan pentru masa mitocondrială (fluorescență verde).

    Analiza Western blot

    Analiza Western blot a fost efectuată așa cum s-a descris anterior. 28 Au fost utilizați următorii anticorpi: policlonal anti-p53 de iepure (FL-393; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-fosfo-p53 de șoarece monoclonal (Ser 15, 16G8; Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-Mdm2 monoclonal de șoarece (D-12; Santa Cruz Biotechnology); anti-Puma policlonal de iepure (Ab-1; EMD Biosciences, San Diego, CA); anti-Bax policlonal de iepure (BD Biosciences, San Jose, CA); anti-Atm policlonal de iepure (Ab-3; Oncogene Research, Cambridge, MA); și anti-β-actină monoclonală de șoarece (AC-74; Sigma Chemical).

    Cuantificarea proteinei intracelulare prin citometrie în flux

    Pentru detectarea intracelulară a p53, celulele au fost fixate cu 2% paraformaldehidă, permeabilizate cu 100% metanol răcit cu gheață și incubate timp de 1 oră la 4 ° C cu anticorpi izotiocianat de fluoresceină (FITC) - anticorp conjugat împotriva p53 sau controlul său izotipic (FITC-conjugat ) set de reactivi anticorpi p53; BD Biosciences). Implicarea modificării conformaționale a Bax a fost analizată prin intermediul unui anticorp îndreptat împotriva regiunii NH2-terminale a Bax (YTH-6A7; Trevigen, Gaithersburg, MD). 31 Fixarea celulară, permeabilizarea și colorarea cu anticorp primar sau un control izotipic au fost efectuate folosind kitul Dako IntraStain (Dako Cytomation, Carpinteria, CA), conform instrucțiunilor producătorului. După spălare, celulele au fost incubate cu anticorpi secundari antimouse de pui Alexa Fluor 488 (sonde moleculare) timp de 30 de minute la 4 ° C.

    Imunofluorescență și microscopie confocală

    Imunofluorescența și examenul microscopic confocal au fost efectuate așa cum s-a descris anterior, 28 cu modificări minore. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS, fixate cu paraformaldehidă 2% și permeabilizate cu metanol 100% răcit cu gheață. Celulele au fost blocate în ser normal de capră 5% timp de 30 de minute, urmată de incubare peste noapte la 4 ° C cu anticorpi policlonali anti-p53 de iepure FL-393 (1: 100 vol/vol; Santa Cruz Biotechnology) și anti-citocrom monoclonal de șoarece c oxidaza IV (10G8, 1 μg/mL; sonde moleculare). După spălare, celulele au fost incubate cu anticorp secundar antirabit Alexa Fluor 488 de pui și anticorp secundar antimouse Alexa Fluor 594 (probe moleculare) diluate în ser normal de capră 5% timp de 30 de minute la 4 ° C. Nucleii au fost contracolorați cu DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Imaginile au fost obținute folosind un obiectiv obiectiv de 60 ×/1,40 PlanApo pe un microscop confocal Olympus FV500 cu software-ul Fluoview versiunea 4.3 (Olympus, Melville, NY).

    ---