Inhibitor proteic al lipazei pancreatice din semințele de Litchi chinensis
Sfântul V. Mhatre
1 Departamentul de Biotehnologie Medicală, Școala de Științe Biomedice MGM, Institutul de Științe ale Sănătății MGM, Sector 1, Kamothe 410209, Navi Mumbai, Maharashtra, India
2 MGMIHS OMICS Research Center, MGM Central Research Laboratory, MGM Medical College and Hospital, MGM Institute of Health Sciences, Sector 1, Kamothe 410209, Navi Mumbai, Maharashtra, India
Amita A. Bhagit
1 Departamentul de Biotehnologie Medicală, Școala de Științe Biomedice MGM, Institutul de Științe ale Sănătății MGM, Sector 1, Kamothe 410209, Navi Mumbai, Maharashtra, India
2 MGMIHS OMICS Research Center, MGM Central Research Laboratory, MGM Medical College and Hospital, MGM Institute of Health Sciences, Sector 1, Kamothe 410209, Navi Mumbai, Maharashtra, India
Raman P. Yadav
2 MGMIHS OMICS Research Center, MGM Central Research Laboratory, MGM Medical College and Hospital, MGM Institute of Health Sciences, Sector 1, Kamothe 410209, Navi Mumbai, Maharashtra, India
REZUMAT
INTRODUCERE
MATERIALE ȘI METODE
Izolarea proteinelor din semințele Litchi chinensis
Determinarea concentrației de proteine
Protocolul modificat pentru micro-testul Bradford (21) a fost efectuat pentru a estima concentrația de proteine izolată din semințele Litchi chinensis. În testare s-au adăugat 10 pl de proteină pe placa cu 96 de godeuri (Tarsons Products Pvt. Ltd, Kolkata, India) și s-au adăugat 200 pl de reactiv 1 × Bradford (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germania). Placa a fost incubată la temperatura camerei (25 ° C) timp de 5 min și absorbanța (A) a fost măsurată la 630 nm folosind un cititor de plăci ELISA (model Readwell TOUCH ™; Robonik, Ambernath, India). Curba standard a albuminei serice bovine (BSA; Sigma-Aldrich, Merck, St. Louis, MO, SUA) (1 mg/ml) a fost reprezentată grafic folosind valorile de absorbanță obținute la diferite diluții cuprinse între 0 și 0,35 mg/ml. Concentrația totală a proteinei izolate din semințele Litchi chinensis a fost calculată din curba standard BSA utilizând următoarea ecuație:
unde A este absorbanța la 630 nm și γ este concentrația de proteine în mg/ml.
Testarea activității lipazei utilizând substrat sintetic
Testul lipazei a fost realizat prin metoda descrisă de Winkler și Stuckmann (22) cu ușoare modificări. Testul a fost efectuat în trei exemplare, utilizând o placă de microtitrare cu 96 de godeuri (Tarsons Products Pvt. Ltd). Soluția de enzimă lipazică pancreatică (5 mg/ml) din pancreasul porcin (Sigma-Aldrich, Merck) a fost preparată în tampon fosfat de sodiu 0,1 M (pH = 8,0) și depozitat la 2-8 ° C până la utilizare. Substratul utilizat în acest test a fost de 4,5 mg de palmitat de p-nitrofenil (Sigma-Aldrich, Merck) dizolvat în 200 μL de N, N-dimetil formamidă (SD Fine-Chem Ltd) și volumul a fost ridicat până la 10 ml prin adăugare Tampon fosfat de sodiu 0,1 M (pH = 8,0). Amestecul de reacție (10 μL de lipază pancreatică, 40 μL de tampon fosfat de sodiu 0,1 M (pH = 8,0) și 150 μL de soluție de p-nitrofenil palmitat) a fost incubat la 37 ° C timp de 30 de minute și absorbanta (A) a fost măsurată la 405 nm la 0 și 30 min. O unitate de activitate lipazică este definită ca cantitatea care eliberează 1 nmol/min de fenol liber din substrat (p-nitrofenil palmitat) în tampon fosfat de sodiu 0,1 M (pH = 8,0) la 37 ° C.
Testul activității lipazei utilizând substrat natural
Testul lipazei a fost efectuat utilizând o metodă titrimetrică ușor modificată (23) cu ulei de măsline (Research-Lab Fine Chem Industries, Mumbai, India) și lipază pancreatică porcină (tip II). Soluția de lipază pancreatică porcină (2 mg/ml) a fost preparată în tampon Tris-HCI (Sigma-Aldrich, Merck) 200 mM (pH = 7,7). Pentru a determina activitatea lipazei, apa distilată autoclavată (2,5 ml), tamponul Tris-HCl (1 ml), uleiul de măsline (3 ml) și enzima lipazică pancreatică (0,5 ml) au fost amestecate bine și incubate într-un incubator cu un ventilator de putere orbital agitator (Neolab Instruments, Mumbai, India) în poziție fixă timp de 30 de minute la 37 ° C. Reacția a fost oprită prin adăugarea a 3 ml de etanol 95% (Labindia, Navi Mumbai, India) urmată de adăugarea a patru picături de indicator de timolftaleină 0,9% (S D Fine-Chem Ltd) preparat în 95%