Identificarea frontierelor și caracterizarea anticorpilor umani derivați de țesut adipos cu

Biologia celulelor B

Editat de
Deborah K. Dunn-Walters

Universitatea din Surrey, Regatul Unit

Revizuite de
TAKASHI HASHIMOTO

Facultatea de Medicină, Universitatea din Osaka, Japonia

Mark L. Lang

University of Oklahoma Health Sciences Center, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

umani

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de Microbiologie și Imunologie, Universitatea din Miami Școala de Medicină Miller, Miami, FL, Statele Unite
  • 2 Sylvester Comprehensive Cancer Center, Universitatea din Miami Școala de Medicină Miller, Miami, FL, Statele Unite
  • 3 Miami Integrative Metabolomics Research Center (MIMRC), Universitatea din Miami Școala de Medicină Miller, Miami, FL, Statele Unite
  • 4 Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă, Departamentul de Chirurgie, Universitatea din Miami Școala de Medicină Miller, Miami, FL, Statele Unite

Introducere

Obezitatea este asociată cu producția redusă de anticorpi de protecție (1, 2) și creșterea producției de anticorpi autoimuni la șoareci (3) și oameni (4). Obezitatea și inflamația aferentă creează un mediu optim pentru dezvoltarea bolilor autoimune, deoarece duce la defalcarea mecanismelor de toleranță anti- „auto”, care, de asemenea, agravează progresia bolii. Rezultatele obținute la șoareci au arătat că șoarecii care au o dietă bogată în grăsimi, în comparație cu șoarecii care au o dietă cu grăsimi normale, au niveluri plasmatice mai ridicate de proteine ​​de șoc termic 60 (HSP60), care sunt asociate cu niveluri plasmatice mai ridicate de IgG2c specific Hsp60 (autoimune )) anticorpi (3). Rezultatele obținute la om au arătat că plasma indivizilor obezi cu rezistență la insulină (IR) conține autoanticorpi specifici proteinelor intracelulare, exprimate omniprezent în țesuturi, inclusiv pancreas, țesuturi nervoase, mușchi sau AT, precum și celule imune (4), sugerând eliberarea de antigeni „auto” în condiții de obezitate în țesuturile țintă ale insulinei. Majoritatea antigenelor „auto” sunt proteine ​​asociate celulelor (Golgi și proteine ​​ale reticulului endoplasmatic, ARN polimerază, glutation transferază, proteine ​​de semnalizare) cu expresie tisulară variabilă.

Din câte știm, nu există date publicate care să arate secreția de anticorpi cu specificități autoimune la AT obeză umană, după eliberarea locală a acestor antigeni „auto”. Am identificat recent mai multe mecanisme responsabile pentru eliberarea de „auto” antigeni în AT obeză umană, cum ar fi hipoxia, citotoxicitatea celulelor NK și deteriorarea ADN-ului, care induc moartea celulelor și eliberarea ulterioară a citokinelor pro-inflamatorii. Am arătat, de asemenea, că anticorpii IgG specifici adipocitelor sunt secretați în AT obezi umani și că celulele AT-B exprimă ARNm pentru citidina deaminază indusă de activare, enzima recombinării de comutare a clasei și hipermutația somatică, precum și pentru factorul de transcripție T -bet și markerul de membrană CD11c, ambii implicați în producerea de anticorpi IgG autoimuni (5). În prezenta lucrare, am caracterizat proteinele „auto” care au stimulat secreția anticorpilor autoimuni în culturile de celule imune derivate din AT. Mai mult decât atât, arătăm că adipocitele exprimă molecule de prezentare a antigenului CD1d și într-o măsură mai mică MHC clasa II și, prin urmare, sunt celule bune care prezintă antigen în AT obeză.

Materiale și metode

Subiecte

Experimentele au fost efectuate folosind AT obezat subcutanat aruncat de la femele supuse unei operații de reducere a sânilor la Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă de la Spitalul Universității din Miami = 20, 25-55 ani), indicele de masă corporală (IMC, kg/m 2) 31-39.

Persoanele care au participat la studiu nu au avut boli și nu au folosit medicamente cunoscute pentru a modifica răspunsurile imune. Am exclus subiecții cu diabet zaharat de tip 2, insuficiență cardiacă congestivă, boli cardiovasculare, insuficiență renală cronică, tumori maligne, boli renale sau hepatice, boli autoimune, boli infecțioase, traume sau intervenții chirurgicale, sarcină sau abuz de substanțe actuale documentate și/sau abuz de alcool.

Participanții la studiu au oferit consimțământul informat în scris. Studiul a fost revizuit și aprobat de către biroul de cercetare al subiectului uman al Universității din Miami, cu consiliul de revizuire instituțională, protocoalele IRB # 20070481 și # 20160542, care analizează toate cercetările umane efectuate sub auspiciile Universității din Miami.

Șoarecii masculi C57BL/6 au fost cumpărați de la Institutul Național de Îmbătrânire și întreținuți în unitatea noastră certificată AAALAC. Șoarecii au fost aclimatizați timp de cel puțin 7 zile înainte de sacrificiu. Șoarecii cu dovezi de boală nu au fost folosiți în aceste studii. În experimentele de aici am folosit 4 șoareci obezi de vârstă mijlocie (12 luni). Toate studiile au aderat la principiile liniilor directoare de îngrijire a animalelor de laborator și au fost aprobate de IACUC (protocolul nr. 16-252).

Izolarea celulelor imune de la AT

AT epididimal de șoarece și AT uman subcutanat au fost recoltate de la șoareci obezi și pacienți obezi supuși intervențiilor chirurgicale de reducere a sânilor, respectiv cântărite și spălate cu soluție de sare echilibrată 1X Hanks (HBSS), așa cum am descris anterior (5, 6). Pe scurt, AT a fost spălat, tocat în bucăți mici, trecut printr-un filtru de 70 μm și digerat cu colagenază tip I (SIGMA C-9263) timp de 1 oră într-o baie de apă la 37 ° C. Celulele digerate au fost trecute printr-un filtru de 300 μm, centrifugat la 300 g pentru a separa adipocitele plutitoare de fracția vasculară stromală (SVF) care conține celulele imune. Adipocitele reprezintă fracțiunea „plutitoare” a AT după digestia colagenazei. Preparatele adipocitare nu sunt contaminate cu celule imune. SVF a fost apoi resuspendat în ACK pentru a liza celulele roșii din sânge, spălat, numărat și utilizat pentru citometrie în flux și in vitro experimente. SVF este un amestec de celule mezenchimale, endoteliale și imune. Fracția imună a SVF izolată din AT a șoarecilor obezi și a oamenilor conține macrofage M1, celule Th1, Th17, Tγδ, celule T CD8 + producătoare de IFN-γ, celule B și celule limfoide innate de tip 1, toate contribuind la secreția de citokine, chimiokine și adipokine pro-inflamatorii și la IR.

Culturi SVF

După izolare, celulele (2 × 106/ml) au fost resuspendate în mediu complet (c-RPMI, RPMI 1640, suplimentat cu 10% FCS, 10 μg/ml Pen-Strep, 1 mM Piruvat de sodiu și 2 × 10 -5 M 2-ME și 2 mM L-glutamină). Culturile au fost lăsate nestimulate timp de 10 zile, apoi supernatantele au fost colectate și măsurate prin ELISA pentru prezența IgG specifice adipocitelor.

Culturile au fost, de asemenea, înființate în absența macrofagelor (MΦ) care au fost îndepărtate prin aderență plastică. Pe scurt, celulele (2 × 106/ml) au fost resuspendate în 1X PBS, incubate timp de 3 ore la 37 ° C în cutii Petri (Falcon 3003), apoi ambele celule neaderente și MΦ au fost numărate cu un hemocitometru. Epuizarea MΦ a fost confirmată prin citometrie în flux.