Hidrogelare peptidică și încapsulare celulară pentru cultura 3D a celulelor cancerului de sân MCF-7

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Hongzhou Huang, Ying Ding

Departamentul de afiliere pentru știința și industria cerealelor, Universitatea de Stat din Kansas, Manhattan, Kansas, Statele Unite ale Americii

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Hongzhou Huang, Ying Ding

Departamentul de Biochimie pentru Afiliere, Universitatea de Stat din Kansas, Manhattan, Kansas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru știința și industria cerealelor, Universitatea de Stat din Kansas, Manhattan, Kansas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru medicină diagnostic/patobiologie, Universitatea de Stat din Kansas, Manhattan, Kansas, Statele Unite ale Americii

Hongzhou Huang,
Ying Ding,
Xiuzhi S. Sun.,
Joi A. Nguyen

Cifre

Abstract

Citare: Huang H, Ding Y, Sun XS, Nguyen TA (2013) Hidrogelare peptidică și încapsulare celulară pentru cultura 3D a celulelor de cancer mamar MCF-7. PLOS ONE 8 (3): e59482. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059482

Editor: Adam J. Engler, Universitatea din California, San Diego, Statele Unite ale Americii

Primit: 17 septembrie 2012; Admis: 14 februarie 2013; Publicat: 20 martie 2013

Finanțarea: Acest proiect a fost parțial finanțat de Programul de excelență țintit KSU și Programul de burse KSU Research Foundation, precum și contribuția (nr. 12-181-J) de la stația de experimentare agricolă din Kansas. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Substraturile bidimensionale (2D), cum ar fi cultura țesutului de polistiren și suprafața analogilor tisulari, aduc o contribuție enormă la studiile moderne de celule in vitro; cu toate acestea, platformele 2D tradiționale nu pot imita cu precizie arhitectura 3D complexă a matricei extracelulare (ECM) în care locuiesc celulele native [1] - [4]. În cultura 2D, celulele monostrat experimentează o concentrație omogenă de substanțe nutritive și factori de creștere care induc medii celulare nenaturale și interacțiuni celulă-celulă, producând o morfologie plană și întinsă [5]. Studii recente au arătat că diferențele morfologice ale celulelor cultivate în 2D și 3D pot prezenta mai multe diferențe izbitoare în procesele celulare subtile, cum ar fi proliferarea, apoptoza, diferențierea, expresia genelor, migrația și sensibilitățile la medicamente [6] - [9]. Pe de altă parte, sistemele 3D biologice in vivo, cum ar fi modelele animale, sunt costisitoare și consumă mult timp. Prin urmare, sunt necesare sisteme avansate de model 3D in vitro pentru a umple golul dintre sistemele 2D inexacte și modelele animale, imitând complexitatea ECM și relevanța fiziologică a unui sistem biologic in vivo.

În acest studiu, o soluție de peptidă nou identificată numită h9e a fost preparată la pH neutru și amestecată cu mediu esențial minim (MEM, cu 10% FBS) la temperatura camerei. După amestecare, peptidele h9e se auto-asamblează într-o matrice de hidrogel cu o concentrație finală de peptidă de până la 1 mM (0,17%). Fără introducerea unui tampon suplimentar de formare a gelului sau ajustarea pH-ului sau temperaturii mediului, peptida oferă un proces convenabil și ușor de formare a hidrogelului și permite celulelor să fie înconjurate de mediul lor de cultură în timpul încapsulării celulare (Tabelul S1). Mai interesant, rezistența mecanică a acestei matrice de hidrogel prezintă o deformabilitate specială și o capacitate de reasamblare, care permit transformarea solubilă în gel prin pipetare repetată. O linie celulară de cancer de sân, MCF-7, a fost selectată ca model pentru a crește în cultura 3D a hidrogelurilor h9e-MEM. Studiile de morfologie, viabilitate și proliferare celulară au arătat că celulele au prezentat cito-arhitectură 3D în matricea hidrogel și au păstrat bioactivități ridicate pentru studii ulterioare după izolare. Cisplatina, un medicament anti-cancer, a fost utilizat pentru a-și examina eficacitatea asupra celulelor MCF-7 într-o matrice de hidrogel. În general, rezultatele arată un puternic sprijin că peptida h9e este un material promițător de cultură celulară 3D pentru testarea medicamentelor.

Materiale și metode

Materiale

N, N-Dimetilformamidă (DMF), Acid trifluoroacetic (TFA), piperidină, N, N-Diizopropiletilamină (DIEA), Triisopropilsilan (TIS), paraformaldehidă, glutaraldehidă, cis-Diamminediclor-platină, 0,4% au fost achiziționați din anticorpi anti-actinici Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI). N-metilpirolidinonă (NMP), eter anhidru, diclorometan (DCM) și bicarbonat de sodiu au fost achiziționate de la Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Rink Amide MBHA Resin, 2- (1H-Benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluroniu Hexafluorofosfat (HBTU) și toți aminoacizii protejați au fost cumpărați de la EMD Biosciences (San Diego, CA). N-hidroxibenzotriazolul (HOBT) a fost cumpărat de la CEM (Matthews, NC). Piruvat de sodiu, aminoacizi neesențiali, MEM cu săruri Eagle, soluție trypsină TrypLE Express, 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) și vopsea fluorescentă Hoechst 33342 (10 mg/ml) au fost cumpărate de la Invitrogen (Carlsbad), CA). Serul bovin fetal (FBS) a fost achiziționat de la Atlanta Biologicals (Lawrenceville, CA). Anticorpii anti-supraviețuire, anti-Ki67 și anti-caspază-3 au fost obținuți de la Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA). Anticorpii anti-iepure/șoareci legați de HRP-caspase-3 și HRP au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Cultură de celule

Linia celulară de cancer mamar uman MCF-7 a fost achiziționată de la American Type Cell Culture (ATCC) (Manassas, MA). Celulele au fost crescute în mediu MEM cu 10% (v/v) FBS, 1 mM piruvat de sodiu, 17,9 mM bicarbonat de sodiu, 0,01 mg/mL insulină și 1% (v/v) aminoacid neesențial. Celulele au fost menținute în baloane de cultură tisulară T-75 cm2 (Greiner Bio-one, Begium) la 37 ° C cu 5% (v/v) CO2. Celulele au fost transmise în mod obișnuit cu tripsină, iar mediul a fost schimbat în fiecare zi.

Sinteza peptidelor și hidrogelarea

Peptida h9e a fost sintetizată conform unui protocol publicat anterior [36]. Pe scurt, peptidele au fost sintetizate pe un sintetizator automat de peptide cu microunde CEM Liberty (CEM Corporation, Matthews, NC) în conformitate cu strategia de bază-labilă 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) cu rășină amidă Rink și aminoacizi protejați cu Fmoc. După deprotejarea finală a grupului Fmoc N-terminal, peptidele legate de rășină au fost deprotejate de lanțul lateral și clivate folosind TFA/TIS/apă (95/2,5/2,5 v/v). Peptidele au fost precipitate și spălate de trei ori cu eter anhidru, dizolvate în acetonitril și apă deionizată (50/50 v/v), apoi liofilizate. Greutatea moleculară și puritatea peptidelor sintetizate au fost confirmate prin spectroscopie de masă în timp de zbor cu desorbție/ionizare cu matrice asistată și cromatografie lichidă de înaltă performanță.

Peptida liofilizată a fost adăugată la 100 mM bicarbonat de sodiu și complet dizolvată prin agitare magnetică timp de 3 ore cu o concentrație finală de peptidă de 10 mM. Pentru hidrogelare, soluția peptidică a fost adăugată în MEM cu 10% FBS și amestecul a fost agitat manual timp de aproximativ 10 secunde. Hidrogelul peptidic s-a format în 15 minute la temperatura camerei cu o concentrație finală de peptidă de 1, 2 și 3 mM.