HGF ameliorează un ficat gras indus de o dietă bogată în grăsimi American Journal of Physiology-Gastrointestinal
Abstract
Factorul de creștere a hepatocitelor (HGF) are diferite efecte în special asupra celulelor epiteliale. Cu toate acestea, rolul precis al HGF asupra lipogenezei nu este încă pe deplin înțeles. O dietă bogată în grăsimi a fost administrată șoarecilor transgenici HGF și șoarecilor martor de tip sălbatic in vivo. Mai mult, HGF uman recombinant (rhHGF) a fost administrat liniei celulare HepG2 in vitro. Am efectuat o analiză cu privire la factorii care se referă la metabolismul lipidelor. O supraexpresie a HGF ameliorează dramatic un ficat gras indus de o dietă bogată în grăsimi. Șoarecii transgenici HGF au prezentat o acumulare lipidică aparent redusă în ficat. Activarea proteinei de transfer trigliceridic microsomal (MTP) și a apolipoproteinei B (ApoB) care însoțesc niveluri mai ridicate de trigliceride în ser au fost găsite la șoarecii transgenici HGF pe o dietă normală. Interesant este că această reglare ascendentă a activării MTP a devenit mai evidentă în dieta bogată în grăsimi. În plus, administrarea rhHGF a stimulat expresia MTP și ApoB, reducând în același timp conținutul redus de lipide intracelulare în linia celulară HepG2. Cu toate acestea, această inducere a MTP și ApoB de către HGF a fost clar inhibată de PD98059 (inhibitor MAPK). În concluzie, datele prezentate în acest studiu au indicat faptul că HGF ameliorează un ficat gras indus de o dietă bogată în grăsimi prin activarea MTP și ApoB.
ficatul gras este o boală frecventă la pacienții însoțiți de obezitate și diabet, iar una dintre principalele cauze ale dezvoltării obezității și diabetului la om este o dietă bogată în grăsimi.
Boala ficatului gras nealcoolic (NAFLD) a crescut ca o afecțiune care în cele din urmă progresează spre boala hepatică în stadiu final. Tabloul patologic seamănă cu cel al leziunilor hepatice induse de alcool, dar apare la pacienții care nu abuzează de alcool. NAFLD afectează 10–24% din populația generală din diferite țări. Prevalența crește la 57,5-74% la populațiile obeze (1).
Deși au fost susținute diferite modalități de tratare a acestei boli (7, 21), nu s-a dovedit că medicamentele definitive îmbunătățesc direct NAFLD.
NAFLD este o leziune hepatică în care anomaliile histopatologice imită pe cele ale steatohepatitei alcoolice (19). Administrarea factorului de creștere a hepatocitelor (HGF) s-a dovedit recent că îmbunătățește ficatul gras alcoolic (28, 29), dar efectul precis al HGF asupra NAFLD rămâne de elucidat. Prin urmare, am investigat dacă administrarea HGF ar putea fi sau nu eficientă pentru îmbunătățirea NAFLD.
HGF este o polipeptidă caracterizată inițial ca un mitogen hepatocitar puternic (10, 20). Studii recente au arătat că HGF este o citokină multifuncțională care poate provoca răspunsuri mitogene, motogene și morfogene într-o varietate de celule epiteliale cultivate care exprimă receptorul transmembrana tirozin kinazei, c-Met (5, 38).
Am dezvoltat și menținut linia transgenică HGF și am dezvăluit mai multe fenotipuri (25, 30, 32). Folosind acest model de șoarece, am examinat efectul HGF în NAFLD cu dieta bogată în grăsimi. Mai mult, studiile ulterioare au condus la înțelegerea faptului că îmbunătățirea leziunii alcoolice a ficatului a fost urmată de reglarea în sus a proteinelor de transfer trigliceridic microsomal (MTP) și a apolipoproteinei B (ApoB) (28, 29). Prin urmare, am efectuat o examinare suplimentară după cum urmează, folosind MTP și ApoB în modelul NAFLD.
MTP este un factor care limitează rata producției de lipoproteine cu densitate foarte mică care conțin ApoB (12, 18, 37). MTP este o proteină intracelulară exclusivă (12) și rolul său principal este de a transfera lipidele pe polipeptidele ApoB din reticulul endoplasmatic al celulelor secretoare de lipoproteine (12).
Am demonstrat aici că o supraexpresie a HGF ameliorează dramatic un ficat gras indus de dietă bogată în grăsimi in vivo. Mai mult, am arătat că acest efect protector al HGF se datorează activării MTP și ApoB.
Șoareci transgenici și tratament.
Șoarecii transgenici (Tg), în care expresia unui ADNc HGF murin a fost condus de promotorul metalotioneinei și regiunile de control al locusului, au fost generați pe fundalul genetic albin consangvin FVB/NCr (denumit în continuare FVB) așa cum este descris anterior (30) . Mai mult, Takayama și colab. au demonstrat că transgenele HGF s-au exprimat în toate organele și au existat mai multe fenotipuri, cum ar fi hepatomegalia, boala chistică însoțită de glomeruloscleroză focală segmentară, ulcerația asociată cu inflamația cronică activă a rectului și așa mai departe (25, 31-33).
Au fost folosiți șoareci masculi Tg și FVB de șase până la 8 săptămâni de tip sălbatic (WT). Toate studiile pe animale au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor stabilite de Consiliul de revizuire instituțională al Școlii de Medicină a Universității Gunma. WT și Tg au fost plasate după înțărcare (vârsta de 3 săptămâni) fie pe o dietă bogată în grăsimi (60% din caloriile derivate din grăsimi; D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ), fie pe o dietă normală de chow (10% din caloriile derivate) din grăsime) din grăsime; D12450B, Research Diets). Șoarecii au fost hrăniți în perechi cu aceste diete timp de 4 săptămâni.
Analize biochimice și histologice.
Lipidele au fost extrase din 50 mg de omogenat hepatic, iar concentrația lipidică pe greutatea hepatică umedă a fost măsurată conform metodei descrise anterior (9). Pentru analiza histologică, țesutul hepatic a fost fixat în paraformaldehidă 4% și încorporat în parafină. Alternativ, lipidele hepatice au fost colorate printr-o metodă O cu ulei roșu. Pentru analiza proteinelor sau a ARN-ului, specimenele de țesut au fost congelate în azot lichid și depozitate la -80 ° C până la utilizare. Concentrațiile serice de alanină aminotransferază (ALT), trigliceride și glucoză serică au fost măsurate cu un autoanalizator clinic standard (Hitachi 7170; Hitachi, Tokyo, Japonia). Nivelul insulinei serice a fost determinat folosind un kit de radioimunologie pentru insulină (Shionogi, Osaka, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. Nivelurile serice de glucoză și insulină au fost măsurate folosind probele extrase după 12 ore de post.
ApoB în ser sau mediu a fost determinat folosind kitul ApoB ELISA (ALerCHEK, Portland, ME) conform instrucțiunilor producătorului.
Analiza ARN.
Celula de hepatocarcinom uman, HepG2, a fost obținută din colecția American Type Culture Collection (Manassas, VA). Celulele HepG2 (2 × 105) au fost însămânțate într-un vas de 35 mm timp de 24 de ore, mediul a fost schimbat cu DMEM fără ser (GIBCO BRL, Grand Island, NY), iar celulele au fost apoi incubate peste noapte. Mai mult, aceste celule au fost incubate timp de 6 ore cu 40 ng/ml de HGF uman recombinant (rhHGF; R&D Systems, Minneapolis, MN), cu sau fără 20 μM de inhibitor MAPK, PD98059 (Sigma-Aldrich Japan KK, Tokyo, Japonia) sau un inhibitor al fosfatidilinozitol 3 kinazei (PI3K), wortmannin (Sigma-Aldrich Japan KK), timp de 1 oră înainte de stimularea HGF. Colecția de ARN, RT-PCR și metodele de PCR în timp real folosind șoareci de țesut hepatic sau celule au fost descrise anterior (17). Detaliile secvenței sunt prezentate în Tabelul 1.
tabelul 1. Secvențe de perechi de grund utilizate pentru amplificarea ARNm prin PCR în timp real
SREBP, proteina de legare a elementului de reglare a sterolului; G6PD, glucoză-6-fosfat dehidrogenază.
Experimente microarray.
Activitate hepatică MTP.
Activitatea hepatică MTP a fost determinată prin utilizarea unui kit comercial bazat pe transferul mediat de MTP a unei lipide fluorescente neutre auto-stinse de la miezul unei particule donatoare la o particulă acceptor (Roar Biomedical, New York, NY).
Analiza proteinei ApoB.
Pentru imunoprecipitare, 1.000 μg de lizat hepatic au fost incubate cu anticorp anti-ApoB (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) timp de 2 ore pe gheață. După adăugarea Gamma-Bind G Sepharose (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germania) și spălarea în tampon RIPA, imunoprecipitații au fost fracționați pe geluri de poliacrilamidă 10% (BIOCRAFT, Tokyo, Japonia). O analiză Western blot a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (17).