Gene exprimate diferențial în ganglionii Hirudo medicinalis după tratamentul cu acetil-L-carnitină

Affiliation Dipartimento di Ricerca Traslazionale e Delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia, Università di Pisa, Pisa, Italy

Affiliation Dipartimento di Biologia, Università di Pisa, Pisa, Italy

Affiliation Dipartimento di Scienze Agrarie, Genetica Alimentari e Agro-Ambientali, Università di Pisa, Pisa, Italy

Affiliation Dipartimento di Ricerca Traslazionale e Delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia, Università di Pisa, Pisa, Italy

Affiliation Dipartimento di Biologia, Università di Pisa, Pisa, Italy

Affiliation Dipartimento di Scienze Agrarie, Genetica Alimentari e Agro-Ambientali, Università di Pisa, Pisa, Italy

Affiliation Dipartimento di Scienze Economico-Estimative e degli Alimenti, Sezione di Chimica Bromatologica, Biochimica, Physiologia e Nutrizione, Università degli Studi di Perugia, Perugia, Italy

Giuseppe Federighi,
Monica Macchi,
Rodolfo Bernardi,
Rossana Scuri,
Marcello Brunelli,
Mauro Durante,
Giovanna Traina

Cifre

Abstract

Citare: Federighi G, Macchi M, Bernardi R, Scuri R, Brunelli M, Durante M, și colab. (2013) Gene exprimate diferențial în Hirudo medicinalis Ganglia după tratamentul cu acetil-L-carnitină. PLOS ONE 8 (1): e53605. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053605

Editor: Tiansen Li, National Eye Institute, Statele Unite ale Americii

Primit: 20 august 2012; Admis: 30 noiembrie 2012; Publicat: 4 ianuarie 2013

Finanțarea: Lucrarea a fost susținută de Laboratoarele Sigma-Tau (Pomezia, Italia). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. Acest lucru nu modifică aderarea autorilor la toate politicile PLOS ONE privind schimbul de date și materiale.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Materiale și metode

Animale

Au fost utilizate lipitori adulți H. medicinalis (în vârstă de 8-10 luni) cumpărate de la Ricarimpex (Eysines, Franța). Animalele au fost ținute într-un acvariu la 15-16 ° C, expuse ciclului de lumină/întuneric natural. ALC sau soluție salină a fost furnizată dorsal prin două injecții (una în rostral și cealaltă în arta caudală a corpului lipitorului), fiecare din 100 pl/g animal, așa cum sa raportat în Ristori și colab. [6]. ALC a fost proaspăt preparat, dizolvat în soluție salină și, dacă este necesar, tamponat la 7,4 pH cu NaOH înainte de utilizare. Soluție salină conținută: NaCl 115 mM, KCl 4 mM, CaCl2 1,8 mM, glucoză 10 mM, tamponată la 7,4 pH cu 10-mM Tris-maleat.

Izolarea totală a ARN-ului

Un grup de lipitori a fost injectat cu soluții fiziologice (grupul martor, C), în timp ce un alt grup cu ALC 2 mM (Laboratoarele Sigma Tau, Pomezia Italia) (grupul tratat, T). La unsprezece zile după tratament, ARN-ul total a fost izolat conform lui Macchi și colab. [23] și stocate la -80 ° C până la izolarea ARN.

Construcția bibliotecii SSH

ARN-urile Poly (A) + au fost izolate din grupurile de ARN-uri totale de control și lipite tratate folosind sistemele de izolare PolyATract® mRNA (Promega, Madison, Wi, SUA) în conformitate cu protocolul descris de producător. Hibridizarea supresivă subtractivă (SSH) a fost efectuată în conformitate cu Diatchenko și colab. [24] folosind kitul de scădere a cDNA BD PCR-Select (BD Biosciences) după utilizarea kitului de sinteză BD SMART ™ PCR cDNA (BD Biosciences Clontech). Procedura SMART necesită 0,025-1 µg de poli (A) + mARN pentru a permite amplificarea populației complete de mARN conținută în fiecare probă (tratată și martor). ADNc-urile din probele tratate au fost utilizate, respectiv, ca tester și driver pentru scăderea directă și inversă, în conformitate cu kitul de scădere a ADN-ului BD PCR-Select.

Secvențele de ADNc amplificate din scăderile înainte și înapoi au fost inserate direct într-un vector de clonare T/A folosind kitul de clonare TOPO TA (Invitrogen, SUA) conform instrucțiunilor producătorului.

Eficiența scăderii a fost evaluată prin amplificarea PCR utilizând gena ribozomală 5.8S (scăderea a fost eficientă dacă transcrierea 5.8S a fost redusă); primerii au fost proiectați pe gena ARNr 5.8S a Xenopus laevis (numărul de acces X02995.1) (Tabelul 1).

Screening diferențial al bibliotecilor ADNc scăzute

Clonele obținute au fost cultivate în mediu LB cu 10 mg/ml ampicilină în plăci cu 96 de godeuri la 37 ° C. Fragmentele de ADNc au fost amplificate prin PCR cu primeri PCR cuibărite 1 și 2R, care erau complementari cu adaptorii, pentru a verifica prezența și dimensiunea fragmentelor individuale.

Secvențierea și analiza clonelor

Clonele exprimate diferențial au fost secvențiate prin secvențierea automată (MWG Biotech Ebersberg, Germania). Căutările omologice ale tuturor secvențelor au fost comparate cu baza de date GenBank EMBL-EBI utilizând algoritmul BLAST.

RT-PCR relativ cantitativ

Transcrierile inversate au fost efectuate cu ARN total (4 µg), tratate anterior cu DNază I (Roche), izolate din lipitori tratate ALC și control cu SuperScript ™ II RNază H- Reverse Transcriptază kit (Invitrogen) și Oligo (dT) 12-18 Grund (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului.

Pentru fiecare amplificare PCR s-au utilizat 1 ofl de ADNc din prima catenă, iar PCR-urile au fost efectuate folosind primeri specifici genei și gena ARNr 5.8S a Xenopus laevis (nr. . 1) au fost folosite ca gene de menaj. Exemple de secvențe sunt raportate în Tabelul 1.

Cantitățile relative ale fiecărui produs PCR au fost cuantificate cu ușurință prin scanare directă cu un densitometru de electroforeză cu gel de agaroză 2% colorat cu bromură de etidiu cu software Quantity One® (Bio-Rad, SUA). Pentru a standardiza ARN-ul total și eficiența sintezei ADNc a probelor, intensitățile benzii au fost standardizate cu intensitatea medie a produsului 5.8S sau Tubulin pe toate probele investigate. Raportul dintre valoarea nivelului produsului genetic analizat și nivelul produsului 5.8S sau Tubulin al fiecărei probe a fost calculat din trei experimente independente efectuate pentru fiecare genă. Analiza statistică a fost realizată cu testul Unpaired T (software GraphPad Prism 4.00). Toate datele sunt exprimate ca valori medii ± SE.