Extractul de medicamente pe bază de plante activează proteina kinază activată AMP la șobolanii obezi induși în dietă

1 Laborator de biologie clinică și farmacogenomică și Centrul de cercetare clinică și genomică, Institutul de medicină orientală, Universitatea Kyung Hee, 26 Kyungheedae-ro, Dongdaemun-gu, Seoul 130-701, Republica Coreea

2 Departamentul de Medicină Preventivă, Colegiul de Medicină Orientală, Universitatea Kyung Hee, 26 Kyungheedae-ro, Dongdaemun-gu, Seoul 130-701, Republica Coreea

Abstract

1. Introducere

Obezitatea datorată dezechilibrului consumului și consumului de energie a atins proporții epidemice în unele părți ale lumii. Pe lângă masa mai mare de grăsime și greutatea corporală [1], obezitatea este asociată cu un risc mai mare de probleme de sănătate, cum ar fi bolile cardiovasculare, rezistența la insulină și diabetul zaharat, hiperlipidemia, artroza, multe forme de cancer și stresul psihologic [2, 3].

OB-1 constă din Semințe de Benincasae, Laminaria japonica Areschon., Pini Folium, Moli Folium, Citrus aurantium Linn. Și Planta efedra (Materia medica, ISBN: 8985897373). Semințe de Benincasae este un diuretic care a fost folosit pentru a elimina toxinele și edemele din organism încă din primele timpuri. Laminaria japonica Areschon sa raportat că are un efect anti-obezitate [4]. Se știe că Pini Folium crește metabolismul lipidic seric și Moli Folium suprimă obezitatea. De asemenea, s-a raportat că Citrus aurantium Linn crește rata metabolică bazală, acționează ca diuretic și reduce activitatea lipazei [5]. Planta efedra este un medicament anti-obezitate bine cunoscut care reduce greutățile corporale [6].

Modificările induse de obezitate ale țesutului adipocitar au ca rezultat modificarea expresiei sau funcției hormonilor endocrini importanți precum leptina și adiponectina. Nivelurile de leptină în post sunt remarcabil crescute în adipocite de la indivizi obezi, iar expresia genică a acestuia este semnificativ crescută la șobolanii cu obezitate indusă de dietă [1, 7]. Spre deosebire de leptină, adiponectina este redusă în țesutul adipocitar de la indivizi obezi [8].

AMPK este cunoscut ca o moleculă cheie care reglează echilibrul energetic, greutatea corporală, aportul de alimente și echilibrul metabolic al lipidelor și glucozei. Activarea AMPK schimbă celulele de la consumul de ATP la procesele active de producere a ATP, cum ar fi acidul gras și oxidarea glucozei. Din aceste motive, AMPK a devenit centrul multor studii recente ca țintă terapeutică a bolilor metabolice [9-11].

2. Metode și materiale

2.1. Pregătirea OB-1

Șase ierburi, Semințe Benincasae, Laminaria japonica Areschon, Pini Folium, Moli Folium, Citrus aurantium Linn, și Planta efedra, au fost cumpărate de la Omniherb (Gyeong Buk, Coreea) și imersate în 1 L de 80% etanol și apoi sonicate timp de 30 de minute. Extractul rezultat a fost filtrat printr-un filtru de sticlă folosind o pompă de vid. S-a folosit un evaporator rotativ sub vid (Eyela, Japonia) pentru a concentra extractul lichid la 45 ° C. Extractul concentrat a fost apoi liofilizat și reconstituit în soluție salină la concentrația de lucru. OB-1 este preparat din aceste șase extracte de ierburi în raport de 1: 1: 1: 1: 1: 1.

2.2. Proiectare experimentală

Șobolani Wistar masculi de patru săptămâni cu greutatea de 140-160 g au fost achiziționați de la Central Laboratory Animal, Inc. (Seul, Republica Coreea). Animalele au fost examinate în conformitate cu Ghidul pentru experimente pe animale editat de Academia Coreeană de Științe Medicale. Patru șobolani au fost adăpostiți pe cușcă sub un ciclu de lumină-întuneric de 12: 12 ore, umiditate de 50% și

° C Componenta nutritivă și raportul compoziției dietelor martor și bogate în grăsimi sunt indicate în Tabelul 1 [1, 12]. Șobolanii au fost hrăniți cu un chow standard pentru pelete de laborator (Purina Co.; Republica Coreea) și s-au aclimatizat în mediul lor timp de 7 zile înainte de a începe experimentul. După aclimatizare, grupul de control (

) a primit o dietă standard de laborator (dieta de control) și grupul de dietă bogată în grăsimi (

) a primit dieta descrisă în tabelul 1. Componenta nutritivă a dietei de control (3.665 kcal/g) a fost 65% carbohidrați, 20% proteine și 4,5% lipide. Dieta bogată în grăsimi (4.058 kcal/g) a fost un amestec care conține alimente umane foarte gustoase (prăjituri, brânză, cârnați, chipsuri, ciocolată și migdale) în proporție de 2: 2: 2: 2: 1: 1 și un cantitate egală (în grame) din dieta de control a laboratoarelor de control. Această dietă bogată în grăsimi conținea 32%, 12% și 31% din energia sa sub formă de carbohidrați, proteine și, respectiv, grăsimi. Animalele au fost cântărite la începutul experimentului și în fiecare săptămână după aceea. După 5 săptămâni de hrănire a șobolanilor fie dietă martor, fie bogată în grăsimi, fiecare grup a fost împărțit aleatoriu în grupuri tratate cu soluție salină sau tratate cu OB-1. Șobolanii au fost hrăniți cu dieta indicată, tratați cu soluție salină sau 40 mg/100 g de OB-1 zilnic timp de 5 săptămâni. Șobolanii au fost sacrificați prin administrarea de anestezie la 10 săptămâni după începerea tratamentului dietetic.

2.3. Mostre de organe

Probele de țesut adipos epididimal și ficat au fost enucleate de la șobolani și spălate în soluție salină rece. Probele de adipocite epididimale au fost depozitate imediat într-un congelator adânc de -70 ° C pentru izolarea ulterioară a ARNm. Probele de ficat au fost fixate peste noapte în 10% formalină tampon neutră (NBF) în pregătirea pentru colorarea histologică. Probele de ficat fixe au fost apoi înmuiate în 30% zaharoză (Sigma; St. Louis, MO, SUA) până când probele de ficat s-au scufundat pe fundul sticlei. După îndepărtarea excesului de lichid din probe, acestea au fost depozitate la -70 ° C.

2.4. Analiza RT-PCR

2.5. Analiza imunoblotului

Țesuturile au fost omogenizate în tampon conținând 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 5 mM EDTA, 150 mM NaCI, 0,1% dodecil sulfat de sodiu (SDS), 1% Triton X-100 și cocktail inhibitor de protează (104 mM AEBSF, 0,08 mM Aprotinin, 2 mM Leupeptin, 4 mM Bestatin, 1,5 mM Pepstatin A și 1,4 mM E-64) pe gheață. Țesutul omogenizat a fost incubat timp de 30 de minute pe gheață, urmat de centrifugare la 14.000 rpm timp de 30 de minute la 4 ° C. Supernatantul a fost utilizat pentru a efectua un test Bradford (Bio-rad) pentru a determina concentrația de proteine. Apoi, 50 μg de proteine totale au fost separate pe geluri de poliacrilamidă reducătoare cu 10% și transferate în membrane. Analiza imunoblot a fost efectuată folosind un anticorp fosfo-AMPK (Cell Signaling Technology; Beverly, MA, SUA) sau α-anticorpul tubulinic și proteinele imunoreactive au fost detectate folosind chemiluminiscență.

2.6. Izolarea celulei grase din adipocite

Celulele adipoase au fost izolate prin tratament cu colagenază, în conformitate cu o metodă descrisă anterior [13]. Pe scurt, probele de țesut adipos epididimal au fost tocate la temperatura camerei și incubate cu 1,5 g/L de colagenază în 10 mL de bicarbonat Krebs-Ringer (KRB; 10 nM HEPES, 6 mM glucoză și 30 g/L ser albumină bovină, pH 7,4, pregazat cu 95% O2/5% CO2) timp de 30 de minute la 37 ° C într-o baie de apă agitată. Adipocitele au fost apoi vizualizate prin microscopie și fotografiate.

2.7. Morfologia ficatului

Probele de ficat fixe descrise mai sus au fost încorporate în compusul de temperatură de tăiere optică (OCT) și 10 μM secțiuni au fost tăiate pe un criostat. Secțiunile de țesut au fost colorate cu Oil Red O (Sigma), pentru a vizualiza lipidele neutre, iar nucleele au fost contracolorate cu hematoxilină (Gill No. 2; Sigma). Oil Red O a fost dizolvat în 99% izopropanol, lăsat peste noapte la temperatura camerei și filtrat cu hârtie de filtru Whatman nr. 2 (Whatman; Marea Britanie). Această soluție stoc a fost amestecată cu apă distilată (2: 3) și re-filtrată cu hârtie de filtru Whatman nr. 2 înainte de utilizare. Diapozitivele care conțin țesut hepatic secționat au fost clătite cu izopropanol timp de 10 min și colorate cu soluția de lucru Oil Red O timp de 15 min. Lamela a fost apoi decolorată cu 70% izopropanol timp de 3 minute, clătită cu apă distilată timp de 5 minute și colorată cu hematoxilină timp de 30 sec. Diapozitivele colorate au primit o spălare finală cu apă distilată, uscate la aer și montate cu jeleu de glicerină.