Endoteliul arterial creează o nișă permisivă pentru expansiunea sângelui din cordonul hematopoietic uman
Abstract
fundal
Deși sângele din cordonul ombilical (CB) oferă promisiuni pentru tratamentul pacienților cu afecțiuni maligne hematologice cu risc crescut și tulburări imune, numărul limitat de celule stem hematopoietice (HSC)/celule progenitoare într-o unitate CB și circumstanțele strânse în extinderea ex vivo îl fac destul de provocator pentru a dezvolta terapii celulare de succes.
Metode
În acest studiu, a fost dezvoltată o nouă strategie pentru a sprijini expansiunea ex vivo a celulelor stem și progenitoare hematopoietice (HSPC) prin cocultură cu celule endoteliale arteriale ombilicale umane (HuAECs-E4orf1-GFP), care exprimă E4ORF1 stabil prin utilizarea unui sistem retroviral.
Rezultate
Cocultura celulelor CD34 + hCB cu HuAECs-E4orf1-GFP a dus la generarea de celule nucleate considerabil mai numeroase, CD34 + CD38 - și CD34 + CD38 - CD90 + HSPC în comparație cu cea a citokinelor singure sau cu cea a coculturii cu venă ombilicală umană celulele endoteliale (HuVECs) după 14 zile de amplificare. Potențialul de diferențiere multilineage in vitro și capacitatea de repopulare in vivo a celulelor hematopoietice expandate coculturate cu HuAECs-E4orf1-GFP au fost, de asemenea, semnificativ îmbunătățite comparativ cu celelalte două grupuri de control. DLL4, un factor determinant major al identității celulelor endoteliale arteriale (EC), a fost asociat cu celule CD34 + hCB amplificate pe HuAECs-E4orf1-GFP.
Concluzii
Colectiv, am demonstrat că HuAEC au acționat ca o nișă permisivă în facilitarea extinderii HSPC-urilor. Studiul nostru a implicat în continuare că factorii cruciale și căile conexe prezentate în HuAEC pot oferi un indiciu pentru a menține auto-reînnoirea HSC-urilor de bună-credință.
Introducere
Celulele stem hematopoietice (HSC), care locuiau în vârful unei ierarhii celulare sanguine complicate, se pot completa prin autoînnoire și pot da naștere tuturor celorlalte celule sanguine [1]. În prezent, generarea de HSC-uri din celule stem pluripotente (PSC), inclusiv celule stem pluripotente induse (iPSC) și celule stem embrionare (ESC), este probabil la îndemână [2,3,4]. Și măduva osoasă (BM), sângele din cordonul ombilical (UCB) sau sângele periferic mobilizat (MPB) este singura sursă de HSC disponibile în prezent [5,6,7]. În consecință, stabilirea unui sistem pentru extinderea ex vivo a HSC ar deschide o oportunitate unică de a studia auto-reînnoirea HSC umană și ar oferi o sursă nouă de celule terapeutice pentru tulburările sanguine. Atingerea acestui obiectiv necesită o înțelegere detaliată a elementelor cruciale care contribuie la amplificarea HSC și la menținerea funcției în nișa hematopoietică in vivo.
AEC-urile primare au capacitate limitată de expansiune și suferă nediferențierea în cultură [17, 18], ceea ce face dificilă aplicarea fiziologică ca nișă de hematopoieză. Din acest motiv, aici am dezvoltat linii stabile HuAEC care dețin caracteristicile convenționale ale AEC prin transducție de E4ORF1 si proteină fluorescentă verde (GFP) folosind vectori retrovirus (HuAECs-E4orf1-GFP). Acestea se bazează pe teoria E4orf1 ca semnal „pro-viață” pentru a promova supraviețuirea celulelor endoteliale primare (PEC) [19, 20]. Apoi am dezvăluit că HuAECs-E4orf1-GFP au potențialul de a crea o nișă permisivă pentru extinderea celulelor CD34 + hCB, așa cum este determinat de un set de markeri definiți în mod convențional pentru celulele stem și progenitoare hematopoietice umane (HSPC), testele coloniei și capacitate de repopulare in vivo la șoareci NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ (NSG). Mai mult, am constatat că moleculele de semnalizare Notch contribuie la efectul de susținere al HuAECs-E4orf1-GFP. Datele noastre arată, pentru prima dată, o legătură funcțională între HuAEC și amplificarea HSC și indică rolul potențial al nișei vasculare arteriale pentru a decoda informațiile in vivo pentru auto-reînnoire și extinderea HSC umane.
Materiale și metode
Izolarea și cultura celulelor endoteliale arteriale/venoase ale cordonului ombilical
Pregătirea și transfecția virusului
HuAECs-E4orf1-GFP și celule endoteliale ale venei ombilicale umane proiectate [20] (HuVECs-E4orf1-GFP) au fost generate prin introducerea unui vector retroviral în HuAEC și HuVEC primare. Retrovirusul a fost generat prin transfectarea MSCV-N E4ORF1 (Addgene, Shanghai, China; specie, adenovirus uman 5; dimensiune, 384 bp plus 8162 bp; tip vector, expresie de mamifer, retroviral; markeri selectabili, puromicină) și pMX-GFP (furnizat de Dr. Hiroyuki Hirai, SUA) în celulele Plat A utilizând Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, SUA). Constructele retrovirale au fost colectate la 44 și 68 de ore după transfecție. E4ORF1-EC transfectate au fost selectate cu 0,5 μg/ml puromicină (InvivoGen, Shanghai, China). DLL4 shRNA și shRNA de control (ambele poartă eticheta GFP) au fost proiectate de Genechem (Shanghai, China) și transfectate individual în HuAEC primare. Celulele GFP + transfectate au fost îmbogățite prin citometru cu flux de versuri (FACS) activat prin fluorescență (BD Biosciences, Franklin, NJ, SUA). Experimentele de transfecție cu virus au fost efectuate pe PEC de la trei donatori diferiți.
Citometrie de flux (FCM)
Analiza citometrică de flux a fost efectuată folosind următorii anticorpi: CD144-PE, CD45-APC, CD133-PE, CD31-APC și CD309-PE pentru HuAEC primare și HuVEC-uri; FVS510, CD34-PE, CD38-APC și CD90-PE-cy7 pentru teste cultivate ex vivo; și CD45-APC anti-uman, CD19-APC, CD11b-PerCP-CY5.5 și CD45.1-FITC anti-șoarece pentru experimente de transplant in vivo. Celulele au fost colorate la 4 ° C timp de 40 min, protejate împotriva luminii. Probele filtrate (70 μm) au fost analizate pe citometrul cu flux invers FACS. Toți anticorpii provin de la BD Biosciences (Franklin, NJ, SUA) sau eBioscience (San Diego, CA, SUA).
Imunofluorescența
HuAEC-urile primare și HuVEC-urile au fost colorate pentru confirmarea identității celulei. Culturile au fost fixate în paraformaldehidă 4% (Sigma-Aldrich, Shanghai, China), permeabilizate și blocate și apoi incubate peste noapte în soluție de blocare care conține anticorp primar împotriva factorului von Willebrand (vWF; 1: 500; Sino Biological, Beijing, China) . IgG anti-iepure de capră conjugat cu FITC (1: 200; Beijing Zhongshan Jinqiao Biological Technology, Beijing, China) a fost folosit ca anticorp secundar și DAPI (1 mg/ml; Roche, Basel, Elveția) ca un antipart de nuclee. Imagistica a fost efectuată utilizând microscopie confocală (PerkinElmer, Waltham, MA, SUA) și Volocity Software (PerkinElmer, Waltham, MA, SUA).
Analiza formării tubului
Pe baza descrierii anterioare [23], HuAEC-urile primare și HuVEC-urile suspendate în mediu EGM-2 suplimentat cu VEGF (100 ng/ml; R&D Systems, Aimolivel, California, CA, SUA) au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri acoperite cu Matrigel ( BD Biosciences, Franklin, NJ, SUA) anterior la o densitate de 10.000 celule/cm2. După 24 de ore de incubație, celulele au fost fotografiate folosind microscopie confocală și software Volocity.
Analiza cantitativă în timp real a reacției în lanț a polimerazei (qRT-PCR)
ARN-ul total a fost extras din celule folosind RNeasy Micro Kit (QIAGEN, New York, NY, SUA) și transcris invers utilizând ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO, Shanghai, China) conform specificațiilor producătorului. Produsele PCR au fost detectate folosind THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Shanghai, China). Exemplele de secvențe utilizate în testele qRT-PCR sunt prezentate în Tabelul 1.