Eficacitatea extractului de frunze de castan de cal ALH-L1005 ca inhibitor al matricei metaloproteinazei în
Vezi Eun Kim
1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.
Tae Hyun Kim
1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.
Parcul Shin Ae
1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.
A câștigat Tae Kim
1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.
Young Woo Park
1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.
Jae Sang Ahn
1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.
Manbok Jeong
1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.
Min-Young Kim
2 AngioLab, Inc. Daejeon 34016, Coreea.
Kangmoon Seo
1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.
Abstract
Introducere
Bolile parodontale sunt cauzate de colonizarea bacteriană parodontală (placa) și de stimularea răspunsurilor imune ale gazdei datorate subproduselor bacteriene [1]. Mai mulți cercetători au demonstrat că modularea farmacologică a răspunsurilor inflamatorii și imune exagerate ale gazdei, pe lângă eliminarea microbiană, este benefică în tratamentul parodontitei [9,23]. S-a raportat că metaloproteinazele matriciale (MMP) au roluri importante în proteoliza componentelor matricei extracelulare [4]. Sub progresia bolii parodontale, gazda și enzimele proteolitice derivate din microbi mediază degradarea matricei extracelulare [23]. Studii recente au arătat că MMP-2 (gelatinaza A) și MMP-9 (gelatinaza B) pot produce distrugerea țesutului parodontal; în plus, s-a raportat că MMP derivate din leucocite polimorfonucleare (PMN) (MMP-8, MMP-9) sunt principalele proteinaze implicate în distrugerea și remodelarea țesutului parodontal [5,11,18]. Alte studii au arătat că probele de lichid crevicular gingival din parodontită conțin MMP-13, care nu a fost găsit în probele din gingia sănătoasă [10]. Astfel, inhibarea MMP-urilor derivate din gazdă poate avea un rol cheie în prevenirea și reducerea progresiei parodontitei.
În medicina populară, produsele de castan de cal (Aesculus hippocastanum L.) și extractele acestora au fost utilizate ca remedii pentru tuse, congestie, artrită și reumatism. În special, extractul de semințe de castan de cal conține aescină, un glicozid acid triterpenic care are efecte antiinflamatoare, antiedematoase, anti-secretoare și tonice [19]. Extractele din semințe de castan de cal sunt disponibile comercial, la nivel mondial, pentru gestionarea insuficienței venoase cronice. Extractele de frunze de castan de cal conțin doar urme de escină, dar sunt bogate în flavonoide, inclusiv quercetină și kaempferol, precum și glicozide flavonolice, cum ar fi quercitrina. Astfel de extracte sunt disponibile comercial pentru injectare și sunt utilizate în tratamentul edemului și insuficienței venoase [2].
Scopul acestui studiu a fost de a evalua efectul clinic al extractului de frunze de castan de cal ALH-L1005 ca inhibitor al MMP asupra progresiei parodontitei la câinii beagle cu parodontită indusă experimental.
Materiale și metode
Protocolul acestui studiu a fost aprobat de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (SNU-080118-2; Universitatea Națională din Seul, Coreea). Toate operațiile experimentale și examinările au fost efectuate sub anestezie generală cu o combinație comercială de zolazepam și tiletamină (5 mg/kg, intramuscular [IM]; Virbac, Franța).
Pregătirea chimică
Frunza de castan de cal (Aesculus hippocastanum L; articolul nr. 38135000) a fost achiziționată de la Kräuter Mix (Germania) și extractul ALH-L1005 preparat după cum urmează: Zece kilograme de frunze de castan de cal uscate au fost extrase cu 200 L de etanol apos 25% pentru 2 h și filtrat. Filtratele au fost concentrate sub vid și uscate pentru a obține 1,73 kg ALH-L1005. ALH-L1005 obținut a fost standardizat cu compusul de referință utilizând cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Pentru administrare orală, s-au format 150 mg capsule de extract ALH-L1005.
Analiza MMP a ALH-L1005
Pentru a stabili cea mai eficientă formulă, activitățile inhibitoare ale MMP ale doxiciclinei, extractului din semințe comerciale (Finzelberg, Germania), extractului din frunze comerciale (Dr. Willmar Schwabe, Germania) și ALH-L1005 au fost estimate experimental. Înainte de testul MMP, MMP-2 și MMP-9 recombinante umane (R&D Systems, SUA) au fost activate cu 1 mM APMA. Activitățile MMP au fost măsurate pe un spectrofluorometru (Perkin-Elmer, SUA) folosind 2,4-dinitrofenil-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg (Calbiochem, SUA) ca substrat. MMP (10 nM) și substratul (1 μM) au fost amestecate în 2 mL tampon de reacție (50 mM Tricină, pH 7,5, 10 mM CaCl2, 200 mM NaCl) împreună cu fiecare material de testat. Intensitatea fluorescenței a fost măsurată la temperatura camerei folosind o lungime de undă de excitație de 280 nm și o lungime de undă de emisie de 360 nm.
Pregătirea gingiei sănătoase
Șaisprezece câini beagle, în vârstă de aproximativ 1,5 ani, au fost folosiți pentru studiu. Toți dinții fiecărui beagle au fost scalați și lustruiți. În următoarea perioadă de 2 săptămâni, periajul dinților a fost efectuat de două ori pe zi fără anestezie pentru a obține starea parodontală optimă. În aceste 2 săptămâni, beagle-urile au fost hrănite cu o dietă dură de tip pelet pentru a menține sănătatea gingivală prin reducerea potențialului de formare a plăcii [20].
Parodontita indusă experimental
După pregătirea gingivei sănătoase, parodontita experimentală a fost indusă după cum urmează: Suturile folosind 2-0 mătase (Ailee, Coreea) cu sârmă ligatură dentară (ClassOne Orthodontics, SUA) au fost legate în jurul regiunii cervicale a PM2, PM3 și PM4 dreapta superioare, și dinții inferiori din dreapta PM3, PM4 și M1. Periajul dinților a fost oprit după ligare și alimentele moi umede au fost administrate timp de 8 săptămâni. Dinții care au fost dezlegați în decurs de 8 săptămâni au fost excluși din studiu. Ligaturile au fost îndepărtate după perioada de inducție a parodontitei, iar câinii au fost împărțiți aleatoriu în 4 grupe: control negativ (NC; numai excipient), control pozitiv (PC; doxiciclină; DongKoo Bio & Pharma, Coreea), ALH-L1005 doză mică test (LT), și testul ALH-L1005 cu doză mare (HT) (Tabelul 1). Toate medicamentele au fost administrate peroral, de două ori pe zi după 6 săptămâni. După îndepărtarea ligaturii, au fost examinați indicatorii de stare parodontală, inclusiv indicele de placă (PI), indicele gingival (GI), adâncimea parodontală a buzunarului (PPD), nivelul de atașament clinic (CAL) și sângerarea la presiune (BoP). Standardele au fost modificate după cum este rezumat în Tabelul 2 [17,26,31]. Toate măsurătorile au fost luate de un clinician cu experiență (SE Kim) folosind o sondă parodontală codată în culori sterile (Helmut Zepf Medizintechnik, Germania).