Efectele Vinclozolinului, un fungicid anti-androgen, asupra personajelor sexuale secundare de sex masculin Guppy și
Finanțat de o subvenție din partea Consiliului danez pentru cercetare în științe naturale.
Mark Bayley, Peter Foged Larsen, Henrik Bækgaard, Erik Baatrup, The Effects of Vinclozolin, an Anti-Androgenic Fungicide, on Male Guppy Secondary Sex Characters and Reproductive Success, Biology of Reproduction, Volume 69, Issue 6, 1 December 2003, Pages 1951 –1956, https://doi.org/10.1095/biolreprod.103.017780
Abstract
În ciuda volumului enorm de cercetări referitoare la diferitele efecte ale substanțelor chimice cu proprietăți perturbatoare endocrine la pești, există încă foarte puține dovezi că perturbarea endocrină poate afecta negativ fertilitatea individuală și, prin urmare, poate pune probleme populației. În studiul de față, gupii (Poecilia reticulata) au fost hrăniți cu fungicidul anti-androgen vinclozolin la concentrații cuprinse între 1,8 și 180 mg/kg de la 8 la 14 săptămâni. Numărul de spermatozoizi masculini și intensitatea comportamentului său de afișare sexuală au fost reduse semnificativ în grupurile de tratament, ceea ce a fost în concordanță cu rezultatele studiilor anterioare. Aici, arătăm în continuare că aceste deficiențe se traduc în fertilitate redusă, măsurată ca mărime a primului ambreiaj al femelei. De asemenea, această fertilitate redusă a fost corelată cu numărul de spermatozoizi masculi, dar nu cu intensitatea afișării sexuale masculine. În cele din urmă, prin încrucișarea expuse cu animale neexpuse, arătăm că efectul advers al vinclozolinului asupra reproducerii este mediat doar prin mascul.
Introducere
În ultimul deceniu s-au înregistrat cercetări intensive asupra posibilelor efecte ale substanțelor chimice care perturbă endocrinul (EDC) asupra oamenilor și faunei sălbatice. Cele mai bine stabilite exemple de perturbare endocrină au fost găsite în mediul acvatic, ceea ce nu este deloc surprinzător, deoarece acesta este destinatarul final pentru multitudinea de EDC suspectate, atât din surse casnice, cât și din surse industriale [1]. Într-adevăr, mediul marin găzduiește cel mai bun (și poate singurul) exemplu stabilit de EDC care provoacă pierderea efectivă a fecundității și a scăderii populației, cu efectele tri-butil-staniu asupra comunităților de moluște [2, 3]. Majoritatea studiilor privind efectele EDC asupra vieții sălbatice acvatice au fost efectuate pe pești. Bărbații prezintă o serie de semne de feminizare, inclusiv niveluri crescute de vitellogenină [4], dezvoltare testiculară retardată [5], număr redus de spermatozoizi [6-8] și comportament reproductiv anormal [6, 7, 9, 10]. Efectele asupra femelelor au fost considerabil mai puțin studiate, dar au apărut rapoarte despre populațiile de pești cu tendințe masculine lângă fabricile de celuloză care pot fi cauzate de masculinizarea femelelor [11-13]. În plus, au apărut numeroase rapoarte privind intersexul într-o varietate de specii de pești, în care țesutul clar identificabil de la ambele sexe se găsește în gonada unui individ (pentru revizuire, a se vedea [1]).
În ciuda acestor numeroase efecte ale EDC asupra peștilor, de la nivel molecular la țesut și organ, foarte puține dovezi susțin orice efecte directe ale acestor substanțe chimice asupra fertilității individuale, care ar putea indica un declin grav al populației în viitor. În laborator, reproducerea peștilor a fost redusă de hormoni sexuali sau analogii lor farmaceutici [14-16], octil fenol [14-17], inhibitorul aromatazei fadrozol [18] și pesticida metoxiclor, despre care se știe că are estrogen proprietăți [14]. Cu toate acestea, aceste studii de laborator au găsit doar dovezi ale succesului reproductiv redus la cele mai mari concentrații testate și două dintre aceste studii au remarcat că efectele asupra reproducerii au necesitat expunerea la o concentrație de peste opt ori mai mare, provocând efecte la niveluri mai scăzute de organizare biologică, cum ar fi vitelogeneza sau histologie [15, 16]. Datele de teren care indică efectele perturbării endocrine asupra fertilității peștilor sunt chiar mai rare, doar un singur studiu arătând o corelație pozitivă între incidența ovotestelor și fertilitatea masculină redusă [1].
Scopul prezentului studiu a fost, în primul rând, de a determina dacă efectele vinclozolinului asupra caracteristicilor sexuale secundare ale masculului guppy se traduc în efecte dăunătoare asupra reproducerii și, în al doilea rând, să încerce să distingă influențele paterne și materne asupra oricărei posibile reduceri a reproducerii.
Materiale și metode
Animale experimentale și acvarii
Animalele experimentale au fost guppi de tip sălbatic (P. reticulata) originari din Columbia în 1997 și de atunci au fost întreținuți la laboratorul nostru în acvarii de 500 litri din oțel inoxidabil. Aceste acvarii au fost menținute la 25 ± 2 ° C și au primit apă dintr-un rezervor aerisit care conține un amestec de apă deionizată, produs printr-un sistem de osmoză inversă și apă de la robinet fără clor la un raport de 5: 1. Mai mult, s-au adăugat 450 mg apă de rezervor de NaCl/L, rezultând un pH de 7,3 și o conductivitate constantă de 600 μS/cm. Această apă a fost utilizată în toate acvariile descrise mai jos. Populația de animale a fost hrănită zilnic cu artemie recent eclozionată și hrană comercială pentru pești (TetraMinRubin, TetraMin și TetraPhyla; Tetra Werke, Melle, Germania).
Trei experimente au fost efectuate în prezentul studiu pentru a distinge efectele reproductive ale vinclozolinului (Riedel-de-Haen AG, Seelze, Germania) mediate prin efecte asupra fenotipului sexual masculin de efectele asupra femeilor înainte de inseminare și efectele exercitate în timpul sarcinii. În primele două dintre aceste experimente, indivizii nou eclozați au fost scoși zilnic din refugiile acvariilor stocate și plasate într-un acvariu din sticlă fără sudură de 80 litri (laboratorul Struers KEBO A/S, Copenhaga, Danemarca) care conține un borcan plin cu pietriș apa a fost reciclată. Acești tineri au fost observați zilnic pentru prima apariție a caracteristicilor sexuale, moment în care au fost separați prin sex în două acvarii identice, dar mai mici (25 L), permițând colectarea femelelor virgine pentru experimentare, ceea ce a fost necesar deoarece guppy poate reține sperma pentru o serie de ambreiaje dintr-o singură împerechere [23].
Expunerea la Vinclozolin
În toate cele trei experimente, gupii au fost expuși la vinclozolin prin alimentele lor folosind acetonă ca solut purtător în soluții stoc. S-au preparat alimente care conțin 0,1, 1,0 sau 10,0 μg de vinclozolin/mg de alimente uscate. Alimentele pentru controale au fost preparate în același mod folosind numai acetonă. În timpul expunerii, gupii au primit în medie 18 mg furaj uscat per gram de pește (începe greutatea umedă) pe zi, rezultând doze nominale medii de 1,8, 18 și 180 mg vinclozolin/kg. Greutatea medie de început a fost determinată prin eliminarea aleatorie a 10 pești din fiecare grup de masculi și femele virgine și femele gravide.
Experimentul de expunere feminină virgină
Șaptezeci și cinci de femele virgine (vârsta, 10 săptămâni) au fost alese aleatoriu din acvariul feminin virgin și 15 au fost plasate în fiecare dintre cele cinci acvarii de sticlă fără sudură (34,5 × 29 × 28 cm) conținând apă la o adâncime de 15 cm și un pietriș borcan de filtrare așa cum este descris mai sus. Două dintre aceste acvarii erau controale; peștii din restul de trei acvarii au primit 0,1, 1,0 și respectiv 10,0 μg de vinclozolin/mg de hrană uscată, respectiv, timp de 30 de zile, timp în care fecalele și alimentele nemâncate au fost îndepărtate zilnic prin aspirație. În acest moment, peștii erau distribuiți în grupuri de trei pești din același tratament în 23 de acvarii de sticlă fără sudură (28,5 × 20 × 22 cm) care conțin apă la o adâncime de 7 cm, un borcan cu filtru de pietriș și o plasă din oțel inoxidabil refugiu (diametru, 8 cm) astfel încât toate acvariile să conțină trei femele virgine. Opt dintre aceste acvarii au servit drept controale, în timp ce toate celelalte tratamente au fost reproduse de cinci ori. După o zi de aclimatizare, a fost adăugat un bărbat adult din acvariul timp de 7 zile pentru inseminare, după care a fost îndepărtat masculul adult. Aceste acvarii au fost monitorizate de trei ori pe zi timp de 45 de zile pentru descendenții nou eclozați, care au fost îndepărtați pentru a evita canibalismul adulților.