Efectele interactive ale carbohidraților indigestibili, tipul de proteine și nivelul proteinelor asupra biomarkerilor

Departamentul de afiliere pentru nutriție monogastrică, Institutul Kielanowski de fiziologie și nutriție a animalelor Academia Poloneză de Științe, Jabłonna, Polonia

Marcin Taciak,
Marcin Barszcz,
Anna Tuśnio,
Barbara Pastuszewska

Cifre

Abstract

Citare: Taciak M, Barszcz M, Tuśnio A, Pastuszewska B (2015) Efecte interactive ale carbohidraților indigestibili, tipul de proteine și nivelul de proteine asupra biomarkerilor de sănătate a intestinului gros la șobolani. PLoS ONE 10 (11): e0142176. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142176

Editor: Mihai Covasa, Western University of Health Sciences, STATELE UNITE

Primit: 10 decembrie 2014; Admis: 18 octombrie 2015; Publicat: 4 noiembrie 2015

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Acest studiu a fost susținut financiar de Ministerul Științei și Învățământului Superior din Polonia, Grant No. N N311 046634. Finanțatorii nu au avut nici un rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Materiale și metode

Animale și diete

Măsurarea pH-ului digestei și a SCFA

PH-ul Digesta a fost măsurat cu un pH-metru WTW/340 pH (WTW GmbH, Weilheim, Germania) și analiza SCFA a fost efectuată utilizând cromatograful de gaz HP 5890 Series II (Hewlett-Packard, Waldbronn, Germania) cu acid izocaproic ca standard intern [9].

Analiza fenolului și a p-crezolului

Concentrațiile de fenol și p-crezol în digestia cecală au fost evaluate pe baza metodelor descrise anterior [10] cu următoarele modificări. Fiecare probă (1,0 g) a fost amestecată cu 1,5 ml metanol și incubată timp de 1 oră pe gheață cu vortexare frecventă. După incubare, probele au fost centrifugate la 12.000 rpm timp de 15 minute la 4 ° C. Supernatantul (500 μL) a fost transferat în flacoane și amestecat cu 15 μL de 5-metilindol ca standard intern. A fost analizat în continuare folosind cromatograful de gaz HP 5890 Series II (Hewlett-Packard, Waldbronn, Germania) cu un detector de ionizare a flăcării și coloană capilară de silice condensată Supelco Nukol ™ (Supelco, Bellefonte, SUA) (60 m × 0,32 mm ID; 0,25 μm). Temperatura cuptorului a fost setată la 55 ° C timp de 1 min, apoi ridicată la 180 ° C la o rată de 20 ° C/min și menținută timp de 25 min. Temperatura a fost apoi ridicată la 200 ° C la 20 ° C/min și menținută timp de 27 min. Temperatura injectorului și a detectorului a fost de 220 ° C și heliul a fost utilizat ca gaz purtător. Durata totală de rulare a fost de 60,25 min. Concentrațiile de fenol și p-crezol au fost calculate pe baza curbelor standard.

Analiza β-glucuronidazei

Activitatea β-glucuronidazei în probele de digestă cecală a fost cuantificată spectrofotometric [9], pe baza cantității de fenolftaleină eliberată de substrat (fenolftaleină β-D-glucuronidă). Absorbanța a fost măsurată la 540 nm folosind un spectrofotometru Unicam UV 300 (Thermo-Spectronic, Cambridge, Marea Britanie).

Analiza amoniacului

Concentrația de amoniac în conținutul de colon a fost cuantificată spectrofotometric pe baza reacției ionului de amoniu cu reactivul Nessler. Proba (0,5 g) a fost amestecată cu 2 ml de apă ultra pură, acidulată cu HCI 1M pentru a regla pH-ul la 5,0-6,0 și s-a omogenizat timp de 30 s la viteză mare. Probele au fost apoi centrifugate la 10.000 rpm timp de 10 minute la 4 ° C. Supernatantul (1,0 ml) a fost transferat într-un tub nou și incubat cu aproximativ 0,18 g de carbonat de magneziu bazic timp de 20 de minute la temperatura camerei, cu amestecare frecventă pentru îndepărtarea ionilor feroși, ceea ce ar putea denatura rezultatele analizei. După incubare, probele au fost centrifugate la 3000 rpm timp de 10 min. Următorii pași au fost apoi realizați utilizând platforma de diagnostic multidisciplinară Maxmat PL (Erba Diagnostics France SARL, Montpellier, Franța). Supernatantul (5 μL) a fost plasat pe o placă de micro titrare, diluat cu 220 μL de apă ultra pură și amestecat cu 25 μL de reactiv Nessler. Absorbanța a fost măsurată imediat la 425 nm și concentrația de amoniu a fost calculată din curba standard preparată folosind soluție de clorură de amoniu.

Cecul și histologia colonului

Probele de țesut au fost încorporate în parafină, tăiate în secțiuni de 5 μm și colorate cu hematoxilină și eozină. Adâncimea criptelor și grosimea myenteronului (15 măsurători pe lamă, două lamele pe probă) au fost măsurate folosind microscopul cu lumină Zeiss Axio Star Plus (Carl Zeiss, Göttingen, Germania) și software-ul de analiză a imaginii Axio Vision LE Release 4.5 (Carl Zeiss, 2002– 2005).

Izolarea colonocitelor și analiza cometei alcaline

Testul cometei alcaline a fost efectuat conform instrucțiunilor producătorului utilizând Trevigen CometSlide ™ (Trevigen, Gaithersburg, MD, SUA) și unitatea de electroforeză orizontală. Imaginile cometelor au fost vizualizate prin colorare cu bromură de etidiu (2 μg/mL) și analizate la o mărire 40X, folosind un microscop fluorescent Olympus BX51 (Olympus Corp., Tokyo, Japonia) echipat cu un filtru de excitație de 510-550 nm și un filtru de barieră de 590 nm . Cometele au fost analizate utilizând software-ul de imagistică Cell D (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Munster, Germania). Pentru fiecare eșantion, 75 de comete selectate aleatoriu au fost alocate la cinci clase de la 0 (nedeteriorat) la 4 (maxim deteriorat). „Intensitatea cozii” a fost exprimată în unități arbitrare [11] și a variat de la 0 la 400.

Efectele interactive ale carbohidraților indigestibili, tipul de proteine ​​și nivelul proteinelor asupra biomarkerilor